盐酸戊乙奎醚对大鼠脑缺血－再灌流损伤的保护作用

许　铁　庞　涛　纵雪梅　梁高永　王志萍　耿德勤　燕宪亮　王厚清

【摘要】目的探讨盐酸戊乙奎醚对大鼠三动脉阻断法急性全脑缺血-再灌流损伤的保护作用。方法144只雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血一再灌流组(生理盐水1 md)、东莨菪碱组(0.01mg／kg)和盐酸戊乙奎醚组(0.01 mg／kg)，缺血前40 min分别腹腔注射相应药物，缺血时间为10min，于再灌流24 h、3 d和7 d测定其行为学(开阔法、平衡木法、攀绳和肌力试验)，再灌流2 h、12 h、24 h、3 d和7 d取材测定海马CAl区存活神经元数量(HE染色)、凋亡神经元数量(TUNEL染色)、bcl-2和bax蛋白表达(免疫组化染色)，部分大鼠于再灌流4 d测定脑梗死体积(TFC法)。结果与缺血．再灌流组比较，盐酸戊乙奎醚组和东莨菪碱组海马CAl区凋亡神经元数量减少(P＜0.01)，bcl-2提前并延长表达(P＜0.01)，盐酸戊乙奎醚组bax表达下降(P＜0.05或P＜0.01)。同时，盐酸戊乙奎醚组和东莨菪碱组存活神经元数量增加(P＜0.05)，脑梗死体积缩小(P＜0.05或P＜0.01)，行为学检测指标改善(P＜0.05)。盐酸戊乙奎醚组较东莨菪碱组作用更加明显(P＜0.05)。结论盐酸戊乙奎醚对脑缺血一再灌流损伤大鼠具有脑保护作用，并且优于同样剂量东莨菪碱。改变bcl-2／bax的比例可能是其机制之一。

【关键词】盐酸戊乙奎醚；脑缺血-再灌流损伤；细胞凋亡；Bcl-2；Bax；大鼠

乙酰胆碱(Ach)是脑内经典的兴奋性递质，作用于M型和N型胆碱受体，与大脑的多种高级神经功能有关。脑缺血时Ach释放异常增加。研究表明Ach可通过M型胆碱受体加强谷氨酸(Glu)诱导的培养海马神经元变性。脑内突触前N型胆碱受体激活后也能够增加包括Glu在内的多种递质的释放。Glu和Ach可能在缺血性脑损伤中有放大的协同作用。盐酸戊乙奎醚是一种新型抗胆碱药物，具有中枢及外周的抗毒蕈碱(M)和抗烟碱(N)样作用，本实验选用盐酸戊乙奎醚为研究药，以东莨菪碱为阳性对照药，通过观察脑缺血．再灌流损伤大鼠的行为学指标、脑梗死体积和神经元凋亡的变化，探讨该药的脑保护作用及其机制。

1材料与方法

1．1动物分组及模型制备

雄性SD大鼠144只(体重200～250 g)，由徐州医学院实验动物中心提供。随机分为假手术组(Sham组)、缺血．再灌流组(I／R组)、东莨菪碱组(sco组)和盐酸戊乙奎醚组(PH组)，每组再继续分为2 h、12 h、24 h、3 d、4 d及7 d共6个时间点(各时间点n=6)。采用三动脉阻断法全脑缺血模型。缺血时间为10 min。Sham组仅游离基底动脉和双侧颈总动脉但不阻断。其余三组分别于缺血前40 min，用生理盐水1 ml(I／R组)、东莨菪碱0.01 mg／kg(Sco组)和盐酸戊乙奎醚0.01 mg／kg(PH组)注射于腹腔。实验中维持动物鼓膜温度在(37.0±0.2)℃至再灌流后2 h。

1．2行为学测定

分别于再灌流24 h、3 d和7 d用开阔法、平衡木法、攀绳和肌力试验测定大鼠行为学变化。

1．3海马CAl区锥体细胞计数

分别于再灌流后2 h、12 h、24 h、3 d和7 d灌注取材，制备冠状连续石蜡切片。取背侧海马中部切片，进行HE染色(存活细胞)、bcl-2和bax免疫组织化学染色(阳性细胞)以及TUNEL染色(凋亡细胞)。光镜下分别计算各切片双侧海马CAl区中段1 mm锥体细胞数目，取平均值进行组间比较。

1．4脑梗死体积测定

再灌流4 d，快速断头取脑，冷冻后由额极向嗅束基底部行连续冠状切片(2 mm)。以TYC染色法计算前脑体积和梗死体积。

1．5统计学方法

数据采用均数±标准差(χ±s)表示，应用SPSS 12．0统计软件处理。组间比较行为学评分采用秩和检验(Kruskal-Wallis Test，两两比较应用扩展t检验法)，其他数据采用单因素方差分析(PostHoc Tests，两两比较应用Scheffe法)。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1行为学测定结果

再灌流后大鼠出现运动减少，平衡木和攀绳积分下降，悬挂时间缩短。再灌流3 d，Sco组和PH组均较I／R组改善(P＜0.05)；PH组较Sco组悬挂时间延长(P＜0.05)。见表1。

2．2海马CAl区锥体细胞计数结果

2．2．1HE染色再灌流24 h，I／R组、Sco组和PH组锥体细胞数目较Sham组减少，并随时间延长而加剧(P＜0.01)；与I／R组比较，Sco组锥体细胞数目增加(P＜0.05)，PH组增加更为明显(P＜0.01)。见表2。

2．2．2免疫组织化学染色再灌流12 h，I／R组、Sco组和PH组bel-2阳性细胞数目较Sham组开始增加(P＜0.01)，I／R组在24 h达到高峰；Sco组和PH组均在12 h达到高峰且持续高表达至24 h。再灌流4 h，PH组bax阳性细胞数目较I／R组减少(P＜0.05)，并持续至3 d(P＜0.01)。见表2。

2．2．3 TUNEL染色再灌流3 d，Sco组和PH组凋亡细胞数目较I／R组减少(P＜0.01)，PH组较Sco组减少(P＜0.05)。见表2。

2．3脑梗死体积测定结果

再灌流4 d梗死灶主要出现于顶颞区皮质、海马和纹状体区。与I／R组相比，Sco组梗死体积和梗死体积百分比缩小(P＜0.05)，PH组缩小更为明显(P＜0.01)。见表3。

3讨论

坏死和凋亡是脑缺血．再灌流损伤的主要形式，坏死位于缺血梗死灶的核心区，而凋亡常分布于边缘区半暗带内。细胞凋亡参与梗死灶的发展，可能最终决定脑梗死体积。目前认为bel-2家族成员bax和bel-2是与脑缺血神经元凋亡关系最密切的调控基因，bcl-2通过和bax形成异源二聚体，发挥抗凋亡作用。实验显示bcl-2过表达在缺血一再灌流和持续缺血这两种模型中均明显促进神经元的存活，bcl-2／bax的比例决定细胞凋亡的趋势。

本实验表明，SD大鼠全脑缺血-再灌流可引起海马CAl区锥体细胞坏死并诱发神经元凋亡。使用盐酸戊乙奎醚可促使海马CAl区bcl-2提前并延长表达，同时抑制bax的表达，减少了凋亡神经元数目，缩小了脑梗死体积并且改善了行为学检测指标。从上述众多指标变化的时间顺序上推断，该药可能通过改变bcl-2和bax的表达发挥脑保护作用。

盐酸戊乙奎醚选择性作用于M₁和M₃亚型受体，避免了对心脏的毒副作用和由于阻断突触前膜M₂亚型受体而导致的不良反应。该药对N₁和N₁亚型受体也有阻断作用，本研究也显示，盐酸戊乙奎醚的脑保护作用较东莨菪碱更加明显，推测可能与其同时阻断N受体有关。与传统M胆碱受体阻滞剂相比，盐酸戊乙奎醚具有起效快，抗胆碱作用强，半衰期长(10.5 h)及毒副作用少等优点。但有关该药的脑保护作用的报道不多。本研究为盐酸戊乙奎醚在脑缺血和脑复苏中的应用提供了实验依据。