血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对大鼠内毒素性急性肺损伤的保护作用

张　泓　孙耕耘

【摘要】目的研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体拮抗剂对大鼠内毒素性急性肺损伤(ALI)的保护作用。方法取wistar大鼠60只，雌雄不拘，随机分为三组：(1)正常对照组(10只)，给予大鼠静注等量生理盐水；(2)大肠肝菌脂多糖(LPS)组，分为3、6、12和24 h四个观察组(每组均10只)，分别给大鼠注射LPS(10 mg／kg)，间隔不同的时间后将大鼠放血活杀，取肺组织待测；(3)LPS+AngⅡ受体拮抗剂组(10只)，先给予大鼠静注AngⅡ受体拮抗剂[sar¹，Ile⁸]AngⅡ(20 μg／kg)处理，然后观察6 h，放血活杀后取肺组织待测。分别以肺湿／干重比、伊文思蓝法测定肺微血管通透性和肺组织病理变化，观察LPS对大鼠肺组织的急性损伤作用以及Ang U受体拮抗剂对该损伤作用的影响。结果与对照组比较，LPS组各时相点大鼠肺组织W／D值显著升高(P＜0.01)，致大鼠肺血管中伊文思蓝染料向组织中渗漏显著增多(P＜0.01)，LPS组出现炎性细胞浸润、水肿等损伤表现，总病理评分达(12.00±2.45)分；LPS+AngⅡ受体拮抗剂组大鼠肺组织湿／干重比、肺微血管蛋白渗出量和组织形态学变化均较LPS组显著好转。结论AngⅡ受体拮抗剂对大鼠内毒素性ALl有保护作用。

【关键词】血管紧张素Ⅱ；受体拮抗剂；内毒素；大鼠；肺损伤

急性肺损伤(ALI)是全身炎性反应综合征在肺部的表现，其本质为肺微血管通透性升高所致的一种血管渗漏综合征。研究证实，一方面内毒素可造成肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascularendothelia1 cell，PMVEc)损伤，另一方面激活的PMVEC在肺局部炎症反应中起积极主动作用，它分泌一些炎症因子及血管活性物质，参与并放大肺局部炎症效应，导致肺内皮通透性增加，致通气／血流比值失衡和肺间质及肺泡水肿，低氧血症，最终导致ALI。

G-菌感染时全身及局部的肾素-血管紧张素系统(RAS)激活，可致循环及组织局部的Ang II浓度升高，但升高的AngⅡ在ALI发生过程中对肺内皮通透屏障究竟产生何种影响，其与G-菌内毒素之间的相互作用如何，鲜见报道。

本研究拟在建立LPS诱导大鼠ALl模型的基础上，观察LPS诱导ALI损伤指标的变化以及Ang II受体拮抗剂对LPS致伤作用的影响。

1材料与方法

1．1主要仪器与试剂

日立-850型荧光分光光度计：日本。BD-211电子天平：SATORIOUS，德国。电热恒温水浴锅：上海市医疗器械五厂。电热真空干燥箱：ZK-82A型，中国。大肠杆菌脂多糖(LPS)血清型(0111：B4)，[sar¹，Ile⁸]AngⅡ，均为美国Sigma公司产品。氯胺酮：上海第一生化药业有限公司。伊文思蓝染料(Evans blue dve，EBD)：美国Fluke公司产品。

1．2模型制作及试验分组

参照路国华等和徐智等方法并加以改进。取Wistar大鼠60只，(安徽医科大学动物中心提供)雌雄不拘，随机分为三组：(1)正常对照组(10只)；(2)LPS组，又分为3、6、12和24 h四个观察组(每组均10只)；(3)LPS＋Ang II受体拮抗剂组(10只)。自制鼠笼固定大鼠，自尾静脉注射LPS(10 mg／kg)；腹腔内注射氯胺酮(20 mg／kg)麻醉；切断双侧颈动脉放血活杀；以0.9％生理盐水50 ml灌注右室直至流出的液体变清亮；迅速将肺脏取出。对照组注射等量生理盐水。LPS＋AngⅡ受体拮抗剂组，先予大鼠静注『Sar¹，Ile⁸]AngⅡ(20 μg／kg)处理，观察6h后，将大鼠放血活杀取肺组织待测。

1．3观察指标与测定方法

(1)肺湿／干重比测定大鼠接受静脉注射后，回鼠笼自由活动，注射完毕开始计时，致伤前和致伤后3、6、12和24 h点采样。取左肺，尽量放出肺血管内残血，清洗肺组织；左肺组织称量湿重；置真空干燥箱，80℃脱水72 h至重量不再变化；烤干后的肺组织称量干重。以肺湿／干重比值(W，D)表示肺组织含水量。(2)伊文思蓝法测定肺微血管通透性分别取0.1％EBD标准品0、5 μl、15 μl、20 μl、30 μl、40 μl，加入4 ml甲酰胺中，绘制EBD标准曲线，激发光波长620 nm，波宽10 nm；发射光波长683 nm，波宽8 nm。将数据进行回归分析，得到回归方程：A=0.011X－0.001，r=0.99。绘制标准曲线。距设定观察时相点(6 h)前30 min，自大鼠尾静脉注射EBD(30 mg／kg)；待染料循环30 min后，将大鼠放血活杀；以0.9％生理盐水50 ml冲洗右室内染料；取右肺下叶，于电子天平上称取湿肺重量；将组织切碎浸入4 ml甲酰胺内；置60℃水浴锅内48 h；取出离心，3900g离心10 min；上机，室温下于620 nm／683 nm处测吸光度。根据标准曲线换算出EBD浓度，结果以mg dye／g hmg tissue表示。(3)肺组织病理观察取右肺中叶以10％福尔马林液(pH 7.2)固定，酒精干燥，石蜡包埋，切成6 μm厚度的切片，HE染色，光学显微镜下观察。(4)病理形态学计分：根据肺间质水肿、肺泡变性、炎细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成和肺不张改变，按程度无、轻、中、重分别计0、1、2、3分，累计总分予统计学处理。

1．4统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差(χ±s)表示，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1肺组织湿／干重比的变化

LPS组各时相点组肺含水量均显著增高，表现为伤后3 h显著升高，6 h达峰值，并持续至24 h。结果表明，静脉注射LPS可致肺组织含水量升高，并在6～12 h内升至最高，导致严重而持续的肺水肿(P＜0.01)。

2．2伊文思蓝测定肺血管内皮屏障蛋白渗出量

LPS组大鼠肺血管中EBD向组织中渗漏显著增多，与正常对照组相比，单位组织中EBD浓度由(20.0±3.7)mg dye／g lung tissue升高至(45.6±2.5)mg dye／g lung tissue(P＜0.01)。

2．3肺组织的病理变化

对照组大鼠肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡内未见水肿液；LPS组3 h时肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润，6 h后，肺内大量炎性细胞浸润，以中性

粒细胞为主，伴出血、水肿和透明膜形成，24 h后肺间质和肺泡水肿较前减轻，总病理评分达(12.00±2.45)分。

2．4ATl受体拮抗剂对大鼠内毒素性ALI的影响

LPS＋AngⅡ受体拮抗剂组肺组织湿／干重比、肺微血管蛋白渗出量和组织形态学变化均较LPS组显著好转，病理评分(1.60±0.33)分，明显低于LPS组(P＜0.01)。说明早期应用[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可减轻ALI，对肺微血管通透性具有保护作用。

LPS组6 h时相点处肺W／D比显著增高，[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可明显减轻该变化(P＜0.01)，[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可显著抑制LPS作用6h的致肺微血管蛋白渗出量增加效应(P＜0.01)，LPS作用可致大鼠肺组织发生明显损伤，而[Sar¹，Ile⁸]AngⅡ可减轻LPS作用所致ALI的病理改变。

3讨论

ALI是多器官功能障碍综合征在肺部的表现，其本质是由内毒素直接或间接损伤肺毛细血管内皮细胞，导致内皮细胞功能障碍，肺毛细血管通透性增高的血管渗漏综合征。内毒素LPS是引起脓毒症后继发ALI的元凶，给动物注射LPS可复制ALI的主要特征，其机制是由于LPS直接或间接损伤PMVEC，使内皮细胞在形态、功能、表面特性等方面发生变化，导致内皮细胞功能障碍，肺微血管通透性增高。目前在内毒素性ALI的基础研究及临床防治方面尚无实质性突破，这就迫使相关研究寻找内毒素对PMVEC损伤作用的新切入点，一旦找到能够控制其作用的切入点，便可有效地防止ALI发生。本研究拟探讨内毒素性ALI时，内毒素对肺微血管通透性的直接影响以及AngⅡ受体拮抗剂的保护作用及其机制。

为探讨AngⅡ受体拮抗剂保护ALI肺微血管通透性的作用机制，笔者首先建立LPS诱导的大鼠ALI模型。实验结果显示，LPS可损伤肺微血管内皮，导致肺含水量及蛋白渗出量急剧增多；表现为肺湿／干重比和EBD值增高，以及特征性的ALI的病理改变。结果还显示，AngⅡ拮抗剂对LPS致ALI有明显保护作用。

肾素-血管紧张素系统(rennin angiotensin system，RAS)为循环激素内分泌系统，AngⅡ是RAS的主要效应分子。近来发现RAS不仅对血压和血流起重要调节作用，还参与并调节炎症反应。有关脓毒症的研究证实，AngⅡ参与并影响LPS致炎反应的不同阶段。AngⅡ与LPS之间的作用在脓毒症极早期是相互拮抗的，AngⅡ可部分逆转LPS对G蛋白耦联受体的损伤效应；随着脓毒症的进一步发展，循环及局部RAS高度激活，AngⅡ水平升高，则对组织或器官功能紊乱的过程起维持和加重作用。AngⅡ本身作为炎性介质还可直接诱导炎症反应。已知AngⅡ可通过多种机制影响肺损伤过程，如对肺泡上皮的促凋亡作用，介导肺动脉高压和纤维化反应等。笔者研究也证实，AngⅡ可致体外培养的PMVEC单层通透性增高。AngⅡ与内毒素之间的作用机制有待进一步阐明。本研究结果表明，AngⅡ拮抗剂对大鼠内毒素性ALI有保护性干预作用，可显著降低大鼠内毒素性ALI的损伤程度，这一结论为临床应用AngⅡ受体拮抗剂治疗ALI提供了理论依据。