心搏骤停后脑复苏研究的动物模型

马宇洁　杨兴易　林兆奋　张　雷　潘曙明

【摘要】目的建立一种新型简便的心跳骤停后脑复苏研究的动物模型。方法选用清洁级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠40只，采用窒息合并冰氯化钾停跳液致大鼠心跳骤停，5 min后开始心肺复苏。记录基本生命体征变化、发生循环停止时间(T_CA)、自主循环恢复时间(T_ROSC)、72 h存活率，复苏后不同时间点(3、6、12、24、48、72 h)神经功能评分(NDS)，观察复苏后3 h和72 h透射电镜下皮层超微结构改变。结果造模后大鼠迅速发生循环停止，R。和TR0s。分别为(137．3±10.2)s，(64.4±9.3)s，复苏成功率87.5％，72 h存活率为80％。NDS在复苏后3 h时最低，以后NDS渐趋好转。血浆丙二醛(MDA)水平显著升高，在72 h略有回降，但仍高于造模前(P＜0.01)。电镜显示复苏后3 h脑损害最严重，72 h逐渐减轻。结论这一模型操作简单且结果稳定。

【关键词】心跳骤停；心肺复苏；脑复苏；动物模型；大鼠

simon等报道25％～50％心搏骤停患者经标准心肺复苏能够恢复自主循环，但出院率仍徘徊在2％～14％的低水平，造成这一差异的原因主要是顽固性神经细胞损伤。心搏骤停后脑复苏研究动物模型的建立对研究复苏后机体病理生理变化、观察药物疗效、改善脑复苏效果等具有重要意义。一种理想的脑复苏动物模型应该具备与临床情况相类似、可重复性好、副反应少且容易操作等特点。在越短的时间内达到心跳呼吸停止的目的就越接近临床状态，实验结果的准确性、可靠性越高。为此笔者设计采用了大鼠窒息合并冰氯化钾停跳液致心搏骤停的模型。

1材料与方法

1．1动物准备

雄性清洁级Sprague Dawley大鼠40只，體重(302.5±5.6)g，由第二军医大学实验动物中心提供，许可证号：SKXK(军)2002－011。饲养室通风、恒温25℃，标准鼠料饲养。称重，氯氨酮10 mg／100 g腹腔注射麻醉，将动物固定于手术台。在右侧腹股沟中点沿下肢纵轴股部切开约1cm切口，分离股动静脉，从股静脉置入20 G套管针连接微量输液泵以2 ml／h的速度输生理盐水，从股动脉置入22 G套管针连接压力转换器，使用西门子Siredoc 220监护仪(德国)监测有创动脉血压并记录标准Ⅱ导联心电图。颈部正中切口，分离气管并插入18 G静脉穿刺导管。左下腹皮肤表面接体表体温探头记录体表温度；肛门插入内置式温度探头记录直肠温度。

1．2模型的建立

手术操作完成并稳定10 min后，经右侧股静脉弹丸式注射氯化琥珀胆碱注射液0.15 mg／100 g和0.5 mol冰氯化钾(4℃)0.12 ml／100 g致呼吸心跳停止，待收缩压(SBP)降至25 nunHg，持续5 min后连接动物呼吸机(江湾I型呼吸机，上海第二军医大学)行机械通气，呼吸频率80次／min，潮气量5 ml／min，FiO₂100％，同时快速进行人工胸外按压，按压频率200次／min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1／3，按压5～10 s后经右侧股静脉快速注射肾上腺素(0.01 mg／kg)并分别记录血压、心电图和体温等参数。出现自主心律、脉搏波且SBP达到60 mmHg时判定为自主循环恢复(ROSC)并停止按压；如按压3 min仍未恢复自主循环则放弃抢救，视为死亡。复苏成功者继续呼吸机支持60 min，若自主呼吸恢复满意即可拔除气管导管，结扎股动静脉并缝合颈部及右股部皮肤，每6 h腹壁皮下注射5％GNS 5 m1，直至动物能自主饮水进食。实验记录及指标参照Utstein模式。

1．3观察指标

1．3．1记录循环停止时间(time of cadiac arrest，T_CA)从开始用药到SBP降至25 mmHg的时间；自主循环恢复时间(time of restoration of spontaneouscirculation，rrRosc)：从开始进行标准心肺复苏至出现自主心律、SBP升至60 mmHg的时间。

1．3．2计算复苏成功率及72 h累计存活率出现自主心律、脉搏波且SBP在60 mmHg时判定为自主循环恢复(ROSC)。

1．3．3神经功能评分(neural deficit scores，NDS)参照Geocadin的神经功能评分方法并加以改良，对大鼠造模前和ROSC后各时间点(3、6、12、24、48、72 h)大鼠从意识、基本反射、运动、感觉、行为学等方面对存活大鼠进行神经功能评定，评分范围为0～80分，0分为脑死亡，80分为完全正常，评分请课题组以外对本课题不了解的人员来完成。

1．3．4血浆MDA含量测定分别对造模前、ROSC后各时间点(3、6、12、24、48、72 h)大鼠抽血测定血浆丙二醛(MDA)含量。按MDA试剂盒要求测定MDA含量。MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1．3．5脑皮质电镜标本检查分别随机选取复苏后3 h和72 h各一只大鼠断头后迅速取出脑组织，以4％多聚甲醛液滴至大脑皮层表面，用锐利刀片切取0.1 cm³(三块0.1 cm³)放人4％多聚甲醛液中冷藏固定。经漂洗、再固定、脱水、包埋、切片、染色后在日立HE-800透射电镜下观察。

1．4统计学方法

计量资料实验数据以均数±标准差(χ±s)表示，采用SPSS 11.5 for Windows统计软件分析。差异比较用ANOVA过程单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2．1血浆MDA含量变化

3 h血浆MDA含量迅速升高并达到顶点，以后逐渐降低，至72 h仍显著高于造模前(P＜0.05)，

2．2脑皮质电镜标本检查

造模前大鼠神经细胞形态、细胞内高尔基体、线粒体均正常；复苏后3 h组神经细胞核内染色质部分凝聚，线粒体肿胀、嵴缺失，高尔基体囊泡明显扩张，基质变淡；复苏后72 h神经细胞周围仍可见水肿带，线粒体肿胀，线粒体电子密度增高。

2．3T_CA和TROSC的变化

模型组大鼠均迅速发生循环停止，T_CA为(137.3±10.2)s。待收缩压降至25 mmHg持续5 min后开始标准心肺复苏，T_ROSC(64.4±9.3)s。

2．4神经功能评分和累计存活率

造模前大鼠NDS均为80分，复苏后3 h NDS最低，以后逐渐升高，至72 h已恢复至70分以上。

5只大鼠复苏失败，复苏成功率87.5％，ROSC后于2、3、5 h各死亡1只。累计存活率80％。

3讨论

3．1实验动物的选择

目前国内外实验研究的脑复苏动物模型多以猪、狗、羊、猴等大动物为研究对象，存在操作较复杂、费用高、周期长，多学科协作等问题。笔者采用的是雄性SD大鼠，因其易于饲养、价格低廉、来源充足，方便操作，且不受生理周期的影响。笔者的实验研究发现，只要熟练掌握插管技术，其操作比建立大动物模型要简单，不需要麻醉师、体外循环医师、心脏外科医师和其他相关人员。购买实验动物的费用和相应的仪器设备等方面节省了大量的科研经费，可以进行大样本的动物模型研究。Von Planta等的研究表明，大鼠在心搏停骤和心肺复苏期间，其血流动力学、酸碱平衡及代谢与大动物甚至与临床患者心肺复苏期间的变化基本一致。目前大鼠被广泛地用做脑损伤和脑保护机制的动物模型，使笔者的研究更具有可比性。

3．2心搏骤停方法选择及临床相关性

目前各实验室心肺复苏动物模型中停跳方法主要包括电击(经右心室导管诱发室颤，体外电击，胸直视电击)、窒息、心房内注射氯化钾、压迫心底血管丛、胸部挤压、主动脉、腔静脉钳夹等，尚缺乏即简单又与临床情况近似的动物模型。为此笔者设计了大鼠窒息合并冰氯化钾的心肺脑复苏模型。通过静脉弹丸式注射冰氯化钾停跳液和琥珀胆碱能迅速停止心脏的电机械活动，使心肌均匀降温，在心搏骤停期间较好地保护了心肌，从而能确保心脏复苏成功，复苏后循环容易维持稳定，因此可满足不同时间心搏骤停后脑复苏研究的需要。琥珀胆碱又名司可林，属去极化肌松剂，可抑制呼吸，造成动物窒息，但持续时间短，故易于控制。与冰氯化钾合用能加快心跳停止的速度，本组实验T_CA为(137.3±10.2)s。

动物实验结果在临床上应用的可能性和有效性很大程度上取决于动物模型模拟临床情况的程度。临床实际发生的心搏骤停是瞬间发生的状态，实验中造膜至心跳停止时间越长，则动物持续低氧时间越长，动物损伤严重，越不易复苏成功。该模型缩短了T_CA，动物可以存活下来，有利于后期研究神经元的迟发性损伤以及观察其神经行为学的改变。此外，动物模型避免了开胸手术，采用股动静脉而不是颈动静脉插管避免了人为对脑血流量和灌流的影响，减少了对实验动物的创伤，更加符合生理状态，适用于脑保护的研究。

3．3心脏停跳安全时限的选择

脑是全身对缺氧最敏感的器官，仅能耐受5～8 min的停循环。各种心搏骤停心肺复苏模型中由于采用致心跳骤停的方法不同，设计的心跳停止时间也各不相同，为3～15 min。笔者分别进行了心搏骤停跳5、6、7 min的预实验，观察72 h，每组各10只，结果7 min组全部复苏失败，6 min组复苏成功3只，分别于3、4、12 h各死亡1只，72 h存活率为20％。5 min组复苏成功9只，T_ROSC(64.4±9.3)s，较易于复苏，3 h死亡1只，72 h存活率为80％。该模型基本符合临床心跳骤停的状态，且大鼠的神经系统与人类相似，亦包括中枢神经系统和周围神经系统两部分，结合预实验结果我们选择心跳停止5 min的模型，结果复苏成功率87.5％，72 h存活率80％，优于国外类似动物模型。

3．4脑损伤程度的判断

在动物模型制备过程中，如果模型动物损伤太轻则不能完全反映临床情况，实验意义不大；损伤太重，则动物死亡率高无法进行后续的研究，同样会降低实验价值。笔者选择了神经功能评分、血浆自由基的水平和神经细胞的超微结构改变来判断脑损伤的程度。以往对缺血缺氧模型多着重观察形态学和实验室指标等的变化，而对最有临床意义的神经功能描述多采用定性或半定量的方法，其结果相对主观和片面，难以准确反映较微小的功能差别。针对这一问题，笔者参照Geocadin的神经功能评分方法并加以改良，从意识、基本反射、运动、感觉、行为学等方面对大鼠进行神经功能评定，以期全面客观的反映皮层、小脑、脑干、丘脑和海马等各个部位的损伤情况并便于对实验结果进行科学的统计分析。MDA的量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。实验结果表明TCA和TROSC、存活率、神经功能评分及神经细胞超微结构的改变有良好的相关性。实验过程中笔者还发现大鼠复苏成功后如死亡多发生在6 h以内，与Shu等研究的心肺复苏后大鼠脑水肿的过程相一致，此阶段脑水肿最严重，与临床情况类似。