ＨＷＴＸ－Ｉ对大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体中自由基损伤的保护作用

周鸿雁 毛海峰 陈嘉勤

摘要：目的：研究虎纹毒素(HWTX睮)对大鼠脑缺血再灌注后脑线粒体MDA含量、SOD和GSH睵x活性的影响，探讨HWTX睮的脑保护作用机制。方法：对脑缺血损伤的SD大鼠在缺血的同时蛛网膜下腔注射HWTX睮，再灌注24 h后测定脑线粒体MDA含量、SOD和GSH睵x活性。结果：脑缺血再灌注后大鼠脑线粒体MDA含量明显增加，SOD、GSH睵x活性明显降低（P＜0.05）；与生理盐水对照组相比，HWTX睮（1ug/kg）治疗组上述指标均有明显改善（P＜0.05）。结论：HWTX睮对缺血再灌注后脑线粒体自由基损伤有一定的保护作用。

关键词：大鼠；HWTX睮；脑缺血再灌注；线粒体；自由基

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)01-0044-03

On the Protective Function of HWTX睮 From the Damage of Rat's Cerebral Ischemia to Hindbrain's Mitochondrial Free Radical after Reperfusion

ZHOU Hong瞴an1，MAO Hai瞗eng2，CHEN Jia瞦in2

(1. Department of Physical Education of University of Arts and Sciences, Changde 415000, Hunan China;2. Academy of Physical Education, Hunan Normal University, Changsha 410081, Hunan China)

Abstract:The thesis was aimed at studying the influence of HWTX睮 on rat's hindbrain content ofmitochondrial MDA, the activities of SOD and GSH睵x after the cerebral ischemia and reperfusion. It explored HWTX睮's protective mechanism on encephalon. The methods of the research were to inject HWTX睮 on subarachnoid cavity while the SD rat which bears the damage of cerebral ischemia was still in the stage of ischemia, and to determine the content of hindbrain mitochondrial MDA and the activities of SOD and GSH睵X after it has been reperfused for twenty瞗our hours. It was shown that content of hindbrain mitochondrial MDA will be remarkably increased while the activities of SOD and GSH睵x be decreased in the same time. Compared with the salt water group, the index of HWTX睮 therapeutic group has obviously been improved. It is concluded that HWTX睮 has protective function on the damage of cerebral ischemia to the free radical of hindbrain mitochondrial after reperfusion.

Key words: rat;Huwenatoxin睮;cerebral ischemia瞨eperfusion;mitochondria;free radical

竞技体育比赛充满激烈的对抗性和竞争性，在各种体育训练和比赛中，遭受运动性创伤甚至引起伤残是运动员经常要面对的事实。而颅脑损伤是运动创伤中较为常见的创伤性疾病，严重的颅脑损伤会造成运动员中枢神经系统的缺血、缺氧，引起神经元凋亡和坏死，其致残率和死亡率均极高。本研究试图通过缺血性脑损伤对大鼠脑皮层组织线粒体中自由基的影响，探讨HWTX-I对中枢神经系统中氧自由基介导的脂质过氧化反应的保护作用。为HWTX-I在脑损伤中的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1实验对象与分组健康雄性SD大鼠32只，6月龄，体重180～250 g，由湖南农业大学实验动物中心提供。按体重大小随机分为A、B、C、D四组，A组为假手术组；B组为生理盐水对照组；C组为HWTX-I高剂量组（1 ug/kg）；D组为HWTX-I低剂量组（0.5 ug/kg）。每组8只，各组分笼饲养，自由饮食，室温(22±3)℃，相对湿度55%～75%。

1．2动物模型制作模型参照改良的Pulsinelli四血管闭塞法制作全脑缺血模型^[1]。10％的水合氯醛（0.4 mL/kg，腹腔注射）麻醉，电凝双侧椎动脉，造成永久性阻断，同时,于第一颈椎和枕骨之间蛛网膜下腔插管；次日，分离颈总动脉，用无损伤的血管夹夹闭双侧颈总动脉7～15 min，造成全脑缺血模型。模型成功标准是：阻断双侧颈总动脉血流后动物立即出现呼吸加快、肢体痉挛、双侧瞳孔放大、痛反射消失、在10 s～1 min内昏迷。血流复通后，动物分别在5～10 min苏醒。手术动物苏醒后表现为：1) 提尾后右前肢内收屈曲;2) 爬行时向右侧划圈(“追尾现象");3) 站立时向右侧倾倒，凡具有上述体征之一者可入选本实验^[2]。未昏迷或缺血后有癫痫、抽搐等并发症的大鼠均放弃。松开血管夹后，生理盐水对照组立即注入生理盐水，1 ug/kgHWTX-I组、0.5 ug/kgHWTX-I组分别注入1 ug/kg、0.5 ug/kgHWTX-I。

1．3标本制备┆所有组24 h后取材，在放置冰块的盘中立即断头，迅速剪开大鼠颅骨，取出大脑组织，剪掉嗅球部分。将脑组织平均分为左右半球两部分，取左脑用于测定。

取脑组织600 mg，SEE介质（250 mM/L蔗糖，1g/L BSA，0.5 mM/L EDTA，0.5 mM/L EGTA，10 mM/L Hepes，PH7.4）洗残血，用预冷的剪刀将脑组织剪碎，加入SEE介质2.4 mL，在冰浴下匀浆2 min后，将匀浆液用SEE介质稀释至8 mL，离心（2 000 g×10 min），取上清液，离心（12 000 g×8 min），取沉淀；加入SEE介质8 mL，旋涡混匀器混匀至悬浮状态，离心（12 000 g×10 min），取沉淀，用IM介质（0.32M蔗糖，50 mmol Tris-HCl，PH7.4）8 mL悬浮，再离心（12 000 g×10 min），取沉淀（线粒体）－80℃保存。以上操作均在0－4℃条件下进行，并在1 h内完成。线粒体提纯后经透射电镜证实。

1．4指标测定脑线粒体的蛋白含量采用考马斯亮兰法测定，SOD活力采用黄嘌呤氧化酶法测定， MDA含量采用硫代巴比妥酸法（TBA法）测定，GSH-Px活性采用DNTB显色法测定，所有试剂为南京建成生物工程所提供的相应试剂盒，冰醋酸为国产分析纯。

1．5数据处理脑线粒体MDA含量、SOD和GSH-Px活性结果以均数±标准差表示。组间差异采用方差分析法，显著性水平为P＜0.05。所有数据均使用SPSS11.0统计软件分析。

2 结果

2.1蛛网膜下腔注射HWTX-I对大鼠脑线粒体MDA含量的影响┆从表1中看出,与假手术组相比,生理盐水对照组MDA含量显著升高(P＜0.05），说明大鼠脑缺血再灌注后过氧化脂质在脑线粒体中堆积增多，而HWTX-I高剂量组可显著降低其水平（P＜0.05）。运用HWTX-I(0.5 ug/kg)，差异无显著性。

2.2蛛网膜下腔注射HWTX-I对大鼠脑线粒体SOD及GSH-Px活性的影响

从表2，表3中看出，在脑缺血再灌注过程中，脑线粒体中SOD和GSH-Px活性变化呈现较一致的趋势，与假手术组相比，两者的活性均显著降低。而HWTX-I高剂量组可显著提高其活性（P＜0.05）。

3 讨论

お

大量实验已证明，在缺血性脑损害进程中，Ca²⁺介导现象起非常重要的作用。在病理情况下，如缺血，缺氧可使Ca²⁺通道开放，当Ca²⁺过多地进入细胞内，就出现Ca²⁺超载，导致神经元及细胞膜的损害，膜转运功能障碍，严重时可使神经元坏死^［3]。线粒体内钙稳态的失调,是造成线粒体损伤的主要原因之一^[4]。Desh-pande等人发现，脑缺血后梗塞灶内出现Ca²⁺的积累，缺血神经元内线粒体有Ca²⁺的沉积，Ca²⁺含量增加程度与神经细胞的坏死数量增多相一致。 Rappaport在大鼠一侧大脑中动脉闭塞试验中，测定缺血脑组织中Ca²⁺含量，发现闭塞4h Ca²⁺含量明显增加，24 h后细胞内Ca²⁺浓度比细胞外大17倍。Siesjo等将Ca²⁺平衡破坏引入脑缺血病理机制中，提出了Ca²⁺内环境平衡的理论，线粒体和胞浆内Ca²⁺超载是缺血性神经细胞损伤的重要因素。Ca²⁺通道阻滞剂(Calcium Entry Blocker，CEB)是一组能够阻止各种病理因素导致Ca²⁺细胞内流的药物。自1963年发现后，主要用于治疗心血管疾病，而近年来，大量实验资料证明此类药物对缺血性脑损伤具有保护作用。因此应用Ca²⁺通道阻滞剂作为一种治疗手段，通过阻止病理情况下的Ca²⁺超载而保护神经细胞，已经成为广泛研究的课题。本实验应用钙离子拮抗剂-HWTX-I，通过结扎双侧颈总动脉和椎动脉四根血管使脑组织缺血、缺氧，引起脑缺血再灌注损伤。

已知氧自由基产生、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、单胺神经递质毒性等可能是造成脑缺血再灌注损伤的重要因素^[5]，但大量研究证明自由基损伤是脑缺血再灌注损伤的关键因素。 氧自由基极易与生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，导致膜的脂质双层结构破坏，膜上的酶功能受损。而自由基介导的脂质过氧化(lipid peroxidation)是最常见的氧化应激性损伤^[6]。 丙二醛(MDA)作为自由基与不饱和脂肪酸反应生成的代谢产物，常被用来间接反应机体的自由基代谢的变化，它作为机体脂质过氧化反应的主要代谢产物，对细胞具有严重的损伤作用。本实验观察到，缺血再灌注大鼠脑线粒体MDA含量显著高于假手术组，说明缺血再灌注造成的氧化性损伤使体内产生大量的自由基，脂质过氧化反应增强，从而进一步加重了脑损伤；这与前人所做结果是相一致的^[7,8]。补充HWTX-I后，脑线粒体中MDA水平明显降低，提示适量补充HWTX-I有助于减轻氧化性脑损伤。

SOD是机体内的一种重要的抗氧化酶， 超氧自由基清除剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着极其重要的作用，此酶能特异性地催化超氧阴离子自由基(O₂^-)的歧化反应。 一般情况下，当自由基代谢增强时，SOD会代偿性增加。而且超氧化物歧化酶对底物显示专一性，它能催化2个•O₂^－和2个•H+相结合形成H₂O₂。在CAT作用下H₂O₂又分解为O₂和H₂O而被清除。因而超氧化物歧化酶(SOD)活性的高低对维护线粒体自由基代谢的平衡尤为重要。它是细胞防御氧自由基的第一道屏障^[9]。

同样，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是生物体内广泛存在的一种催化过氧化物分解的酶，能特异地催化还原型谷胱甘肽(GSH)对过氧化物(如H₂O₂)的还原反应，清除组织内的H₂O₂的过氧化物。免除它们对生物细胞的毒害作用。这一作用对于保护生物膜及生物大分子免受自由基损伤十分重要^[10]。GSH-Px活性下降，据文献资料记载，这种情况可能是由于GSH-Px活性中心的硒代半胱氨酸残基易被自由基链式反应产生的多种有机氧化物所氧化，该酶的肽链还可以被羟自由基(OH-)裂解而失去活性。

本实验结果显示，缺血再灌注大鼠脑线粒体中SOD、GSH-Px活力均显著低于假手术组。说明在脑缺血再灌注过程中产生了大量的自由基，体内抗氧化酶活性下降，自由基清除能力降低;这个结果与前人所做研究相一致： 刘学忠等报道缺血再灌注后大鼠脑组织中SOD、GSH-Px活力均显著低于假手术组，且再灌注后6 h，活力降至最低，随再灌注的时间延长，抗氧化酶活力有逐渐升高的趋势，但至再灌注5 d时，活力仍明显低于假手术组^[11]。冯加纯等报道了大鼠全脑缺血10 min再灌后，各脑区SOD在6 h内迅速降至最低水平，然后逐渐回升，但在第7 d时仍低于对照水平。 补充HWTX-I后，SOD、GSH-Px活力均明显升高，说明HWTX-I可通过增强体内抗氧化酶活力减轻脑缺血再灌注损伤。

从以上结果可见，MDA含量、GSH-Px和SOD活性三个指标从氧化与抗氧化系统两个不同方面证实了缺血性脑损伤后再灌注过程中产生了较多的自由基，再一次有力地支持了脑缺血后再灌注损伤的自由基学说。同时研究结果表明：在脑缺血再灌注损伤后如果能及时、适量地将HWTX-I进行蛛网膜下腔给药，能够显著降低大鼠脑线粒体中MDA含量，增强抗氧化酶能力，对脑缺血再灌注损伤产生保护作用。从而为缺血性脑损伤疾病的治疗提供实验依据，在临床及理论上都具有较深远的意义。深入开展HWTX-I在脑缺血缺氧损伤性疾病治疗中的研究，一方面有助于了解缺氧缺血的分子和细胞机制，更主要是为脑损伤性疾病的临床治疗寻找新的有效药物。

4 结论

お

HWTX-I蛛网膜下腔用药可以改善缺血性脑损伤对脑组织线粒体中自由基的影响，对中枢神经系统起保护作用。

参考文献：

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