抑制消减杂交技术在瓜菜作物研究中的应用

胡宝刚　刘　莉　焦定量

摘要：抑制消减杂交(SSH)是一种适用于分离2个遗传背景相关的样品之间差异表达基因的技术，目前该技术在植物研究中的应用不是很多。文章主要综述了抑制消减杂交技术在瓜菜类作物不同发育阶段和抗病、逆境胁迫相关的差异表达基因以及其他相关差异基因研究中的应用现状。

关键词：抑制消减杂交；差异表达基因；瓜菜；抗病；逆境胁迫

随着分子生物学的迅速发展以及部分生物的基因组全序列测序的陆续完成．生命科学的研究热点已经从结构基因组研究转向基因功能及表达调控的功能基因组研究。因此．大量基因克隆的新技术也不断涌现．其中以1992年Liang等提出的mRNA差异显示技术(mRNA differential display re—verse transcription PCR．DDRT-PCR)，1994年Hubank等提出的代表性差别分析(representational diffefence analysis．RDA)技术．1996年Diatehenko等提出的抑制消减杂交(suppression subtractive hybriion，SSH)技术及1998年Kang等提出的交互差减RNA差别显示技术(reciprocalsubtraction differential RNA display，RSDD)为代表。

抑制消减杂交(SSH)技术是一种能高效快速克隆差异表达基因的新技术．该技术是Diatehenko等在抑制PCR(sup-pression polymerase chain reaction)的基础上建立起来的筛选差异表达基因的方法．通过该技术人们可以比较同一细胞或组织在不同的生长发育阶段或不同的生理条件下基因表达的差异，并富集、分离、克隆出这些差异表达基因进行功能研究。ssH起初多应用在动物(包括人类)等生物医学领域，而在植物研究领域尤其是瓜菜作物研究中只得到初步应用。在瓜菜作物上应用该技术．通过分离克隆相关差异表达基因可以为分析其生长发育和抗病、抗逆性规律，阐明作用机理提供重要的信息基础。本文在介绍SSH技术原理及特点的同时．着重总结其在瓜类和蔬菜作物研究上的应用进展情况。

1抑制消减杂交技术

1．1基本原理

抑制消减杂交(SSH)主要基于抑制性PCR与eDNA消减杂交(subwaefive hybridization)技术。所谓抑制性PCR就是通过利用含引物序列的双链接头(adaptor)，使非目的片段两端接上同一接头．该接头具有反向末端重复序列，在退火时链内退火优于链间退火．使非目的序列片段产生类似“锅柄”的互补结构．在PCR时无法与引物配对．从而选择性抑制非目的序列的扩增。SSH的消减富集则运用了杂交二级动力学原理．即高丰度单链在退火时杂交形成双链的速度快于低丰度单链．从而使原来在丰度上有差别的单链相对含量达到基本一致．即低丰度差异表达的基因不会丢失．而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。

SSH基本过程：(1)提取2种差异细胞或组织的mRNA，其中包含差异表达基因的为检测组(Tester)，另1组为驱动组(Driver)，分别反转录合成eDNA，并用限制性内切酶Rsa I酶切为平头末端dscDNA片段。(2)将酶切后的Tester eDNA分为2份，1份与接头l(adaptorl)连接．另1份与接头2R(adaptor2R)连接．接头3端与eDNA片段5端连接。接头外侧序列(图l中接头黑色部分)与第1次PCR引物(PCR primerl)相同，而接头内侧序列分别与第2次PCR2个引物(nested primerl和nestedprimer2R)相同。(3)分别向连接不同接头的TestercDNA中加入过量Driver eDNA．进行第l轮杂交．得到4种产物：a为差异表达的单链tester eDNA~b为自身退火的TestereDNA；e为异源退火Tester／Driver eDNA(共有序列形成异源杂交产物)：d为自身退火的Driver cDNA。第2轮杂交时．将第1次2份杂交产物在新鲜变性DrivereDNA存在的条件下混合杂交，进一步去除共有序列．杂交完毕产物中形成一种特殊类型的e型分子．它是检测组中含有的而驱动组中没有的eDNA片段．由第1轮杂交中形成的连接有不同接头a片段退火形成。(4)2次选择性PCR扩增：第2轮杂交后补平接头．第1次PCR扩增时引物为PCRprimer 1．a、d型分子无引物结合位点不能扩增：c型分子为单接头，只能线性扩增Ib型分子两端接头相同。由于接头上有退火温度很高的反向重复序列．形成“锅柄”结构．受抑制PCR效应。故不能被扩增。只有目标片段形成的e型分子两端连有不同接头。以指数级大量扩增。第2次PCR扩增时。换用接头内侧引物(nested primerl和nested primer 2R)进一步选择性扩增目标片段。经过2轮消减杂交和2轮选择性PCR．目标片段已被大大富集．其产物可以直接用于克隆构建消减文库。

1．2特点

SSH技术操作流程比较简单、周期短．且有市售的试剂盒可供利用．技术难度不大；该技术方法可以使低丰度的mRNA得到高于1000倍的富集．灵敏度高．较适于在转录水平上研究生物基因的差异表达：1次SSH反应可同时分离上百至上千个差异表达的基因片段．适用于大规模的基因表达分析。效率高且假阳性率低。但SSH技术仍有它的不足之处，如所需的起始mRNA量较大(一般为几ug)，如果mRNA量不够．2次差减后有些关键的、低丰度表达的差异eDNA片段可能检测不到．而且SSH获得的eDNA片段一般较短。要想获得全长序列就要用这些基因片段作为探针从eDNA文库中筛出全长基因。

2抑制消减杂交技术在瓜菜作物研究中的应用

目前SSH技术在医学研究领域已有成功的报道．国内外学者已成功将SSH技术运用于研究机体各种疾病相关基因表达、免疫细胞和组织的基因调控、肿瘤相关基因以及某些耐药性基因的克隆等方面。实践证明，SSH技术也特别适合于研究植物发育阶段转型前后、个体内不同器官之间以及受环境因子影响较大的差异表达基因的克隆。

2．1在瓜菜作物发育生物学中的应用

植物体内大部分基因都是时空表达和诱导表达的．在植体内的不同发育时期、不同组织器官基因的表达不同。研究不同发育阶段、不同组织器官基因的差异表达．对于研究瓜菜类作物的生长、发育和衰老等规律并应用到实践育种中具有重要的意义。

肖钢等以授粉后27 d的种子mRNA为检测组．授粉后7 d的种子mRNA为驱动组利用SSH技术构建了甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库，得到560个克隆．对456个PCR阳性克隆进行斑点杂交．得到201个上调的阳性斑点杂交克隆，测序得到有效ESTs序列198个。BLASTN结果显

示，134个ESTs可能是新基因．另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列．这64个ESTs序列和编码已知功能蛋白(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的基因有高度相似性．马春泉等㈣利用SSH技术构建了甜菜M14品系在花期的ZAP表达载体的eDNA文库．获得的M14品系特异表达的2个EST片段即eDNAMe286和Me284；采用RACE技术获得了基因M14286 cDNA片段的全长序列。生物信息学分析发现M14品系特异表达基因M14286的eDNA片段与eDNA片段Me284分别与大花马齿苋(Portulaca grandilrIora)及瓶子草(Sarracenlapurpurea)的26S核糖体RNA具有很高的同源性。

周增光等以矮化突变的甘蓝型油菜茎尖为检测组．野生型茎尖为驱动组．通过SSH构建了与植株高矮性状关系最密切的茎尖差异表达eDNA差减文库．利用反向消减cDNA文库斑点印迹筛选得到30个阳性克隆．序列测定和同源性比对分析表明，所得克隆的功能涉及第2信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面．为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础。Park等通过SSH技术构建了绿色和红色莴苣(生菜)叶片的差减文库，利用no．hem杂交技术检测到566个克隆中有53个在红叶片中过量表达．其中6个上调基因中CHS、F3H和DFR基因的表达与紫外线照射下莴苣叶片中花青素的积累正相关．这对进一步研究蔬菜作物的次级代谢提供了有价值的资源。Zhou等通过SSH和RT-PCR技术研究了甘蓝型油菜无瓣花突变体Apet 33-10的花器官形态发生和差异表达基因．发现在花器官形成过程中不能观测到花瓣原基而其他器官形成正常．在Apet 33-10早期花芽分化中有18个基因表达下调．这些基因与包括花瓣特异表达．钙离子信号转导，mRNA加工。蛋白合成与降解，细胞骨架构建．核酸结合和生物碱的合成等相关。Terefe等以黄瓜两性花花芽eDNA为检测组．以雌株花芽eDNA为驱动组．通过抑制消减杂交得到了178个eDNA克隆。其中选出21个做点杂交发现有11个克隆是仅在黄瓜两性花花芽中表达的、10个是雌株花芽中差异表达的。为进一步分离决定花性型的基因提供了基础。植物花性型的分化是一个高度复杂的、在一定遗传背景控制下的生理生化及形态发生过程．瓜类不同花性型的研究一直以来都是育种研究的重点．用SSH技术分离相关的诱导表达型基因和不同花性型差异表达基因．揭示瓜类作物花性型分化的分子机制．对于其育种工作具有重要的理论和实践价值。

2．2在瓜菜抗病虫研究中的应用

病虫害的发生是影响瓜菜作物高产和优质的重要因素．探索瓜菜作物抗病、抗虫基因作用的分子机制是开展和实施瓜菜基因工程的重要基础．SSH技术的应用无疑为这类研究提供了一种很有效的工具。

Kirankamar等㈣从SSH文库中分离到600个Pro基因在番茄里过量表达而可能产生的特异基因．然后结合微阵列技术分析了Pro过量表达的抗性株与感病株在接种番茄叶霉菌后的不同时间里这些基因的表达谱．最终鉴定出223个Pro过量表达的特异应答基因。茆振川等以含Ⅳ基因的辣椒为试验材料，接种南方根结线虫12、24、36 h的根尖材料作为检测组，相应的未接种的根尖材料作为驱动组．构建1个南方根结线虫诱导Ⅳ基因表达早期的正向抑制消减杂交eDNA文库，并结合文库高密度点阵膜杂交差异筛选．获得237个ESTs，在GenBank上进行比对分析得到148个功能已知的EST序列，获得68个已知的表达上调的抗性相关ESTs．分离出了具有NBS-LRR结构的抗线虫蛋白和类LRR抗性蛋白的基因，防御作用相关的类萌芽素(GLP)、HSR203J蛋白、蜜腺蛋白、蛇毒素肽等基因，抗性相关的WRKY、ERFBP等转录因子基因，以及G蛋白、14-3-3蛋白等多种信号蛋白基因．为了解抗线虫机制提供了依据。

Xu等利用SSH技术构建了尖孢镰刀菌诱导西瓜根的消减文库．共得到562个高质量的ESTs．经过功能注释后发现，最普遍的一类EST序列是与病害和防御相关的，约占33．5％．其次是与信号转导作用相关的EST序列约占13．1％．序列分析认为系统自身获得性抗病是西瓜对尖孢镰刀菌产生抗性的主要原因。赵熙等_1句成功利用SSH技术构建了富集大白菜干烧心病的相关基因的消减cDNA文库．采用PCR方法对该文库进行了重组子鉴定．共得到831个重组子．该文-库的构建成功地为深入研究大白菜干烧心发病后基因的表达奠定了基础．为进一步探讨研究大白菜干烧心病的致病机理提供了参考。

2．3在逆境胁迫下差异表达基因研究中的应用

植物在不同的逆境条件下会表现出具有一定的抗性．分析不同逆境胁迫下的差异表达基因及分离克隆差异表达基因并进行功能分析．有助于阐明逆境调控通路．对进一步揭示逆境胁迫的分子调控途径具有重要的作用．

Maya等利用SSH和cDNA-AFLP技术研究鉴定了氟乐灵除草剂诱导甜瓜抗镰刀菌枯萎病．消减文库得到共123个克隆。经过测序分析，其中60个为未知基因，35％的克隆为已经报道的与胁迫、防御相关的基因．随机挑选32个克隆进行进一步分析发现：当用氟乐灵处理时1／3的基因上调．而甜瓜植株用高盐处理时有4个胁迫相关基因的表达增强．说明氟乐灵能够诱导植株的胁迫应答反应．从而保护植株防卫镰刀菌枯萎病。解莉楠等以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为检测组．非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为驱动组，利用抑制性消减杂交技术构建了盐碱胁迫下羊草消减文库，筛选出1920个阳性克隆．将得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对．其中有548个与数据库中的序列有同源性，其中功能已知的339个．功能未知序列209个，获得了与盐碱胁迫相关的基因．为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础。Mi等通过抑制消减杂交技术分离鉴定了黄瓜的低光照诱导的基因，以100 txmol／m2·s处理的幼苗eDNA为检测组．800Ixm01／m2-s处理的幼苗cDNA为驱动组构建了消减eDNA文库，得到768个重组子克隆，其中246个为低光照诱导克隆．经过测序比对64个ESTs中有50个在GenneBank中能够找到同源序列，14个ESTs为分离得到的新基因。Thay等利用SSH技术从6度处理48 h的玉米幼苗中分离鉴定一些新的基因．这些冷冻诱导基因与起信号转导和光合作用调节的已知蛋白功能近似。通过RT-PCR选出1组基因分别命名为：ZmC016．ZmACAI，ZmDREB2A和ZmERF3，证实这些基因都是低温逆境胁迫下表达的。SSH技术在植物逆境胁迫基因的克隆中成功应用．为更深入利用该技术分离瓜菜作物抗性基因提供了重要的方法指导。

3结语

当前将瓜菜作物研究的重点一直放在育种工作中。而抗病虫性和抗逆性一直是重要的育种目标．但由于对相当部分病虫胁迫机制并不清楚．发挥抗性的主效或专一基因需要进一步明确．启动抗性反应的信号转导等问题需要进行深入的研究。SSH技术的出现和成熟无疑将成为瓜菜作物差异基因表达研究的强有力工具。利用该技术可以广泛地开启各种病虫胁迫、逆境胁迫条件下的基因差异表达的研究．深入了解抗病虫的机理机制．将为优良品种的选育提供理论依据和资源。

虽然SSH技术已经成功应用于部分瓜菜作物生长发育过程中的差异表达基因、抗病虫特异表达基因、逆境胁迫条件下差异表达基因以及其他相关基因的研究中。但应用范围还很有限。近几年在国内外研究中出现了多种新技术与SSH技术结合．使SSH技术日臻完善．在瓜菜作物研究上的应用也越来越多。显示出了广阔的研究前景。