高效液相色谱法测定利塞膦酸钠的含量

万维香，瞿建江

（江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300）

高效液相色谱法测定利塞膦酸钠的含量

万维香，瞿建江

（江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300）

目的建立测定利塞膦酸钠含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为汉邦C18柱（250 mm×4.6 mm,5!m），流动相为缓冲液（含5 mmol/L磷酸二氢铵、2 mmol/L四丁基溴化铵、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠，用氢氧化钠调节pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v），流速为1 mL/min，检测波长262 nm。结果辅料及中间体对样品测定不产生干扰，利塞膦酸钠质量浓度在4.2～37.8!g/mL范围内与峰面积有良好的线性关系，平均回收率为100.5%，RSD为1.1%（n=9）。结论该法可以用于利塞膦酸钠的含量测定。

利塞膦酸钠；含量；高效液相色谱法

利塞膦酸钠(sodium risedronate)用于治疗骨质疏松，可有效抑制骨吸收、改善骨质结构，效果良好[1]。与其他双膦酸盐类药物相比，利塞膦酸钠具有高效、安全、服用剂量小等优点，有着良好的发展前景[2]。其常用的含量测定方法是采用有机破坏后比色法测定分子中磷的含量，再换算成利塞膦酸钠的含量。笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定了其含量，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国），包括Waters1525泵、Waters2487检测器、汉邦HB230A柱温箱；Breeze色谱工作站。利塞膦酸钠对照品（纯度为86.3%，批号为 20080321）及样品（批号为 20060601，20060602，20060603），均自制品；水为重蒸水（自制）；甲醇为色谱纯（汉邦科技有限公司，批号为200605072），磷酸二氢铵，乙二胺四乙酸二钠，四丁基溴化铵，氢氧化钠。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：汉邦 C18柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流动相：缓冲液（含5 mmol/L磷酸二氢铵、2 mmol/L四丁基溴化铵、1.5 mmol/L乙二胺四乙酸二钠、用氢氧化钠调节pH至7.2）－甲醇（75∶25，v/v）；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：262 nm；进样量：20!L。在此条件下，色谱图见图1。理论塔板数按利塞膦酸钠峰计算不低于4 000。

2.2 溶液制备

取利塞膦酸钠对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含利塞膦酸钠20!g的溶液，即得对照品溶液。取利塞膦酸钠样品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含利塞膦酸钠20!g的溶液，即得供试品溶液。

2.3 方法学考察

空白干扰试验：分别精密吸取2.2项下溶液及空白辅料溶液注入液相色谱仪，记录色谱图（图1）。结果表明溶剂及空白辅料溶液对利塞膦酸钠含量测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：精密称取利塞膦酸钠对照品适量，用流动相溶解，制成质量浓度分别为 4.2，12.6，21.0，29.4，37.8!g/mL 的对照品溶液。精密吸取上述溶液各20!L，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积。以峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性回归，得回归方程 A=11 019C －4 048.8，r=1.000 0（n=5）。结果表明利塞膦酸钠质量浓度在4.2～37.8!g/mL范围内与峰面积线性关系良好。

回收率试验：分别按已知样品含量75%，100%，125%的量，加入利塞膦酸钠对照品和处方配比的辅料于量瓶中，依法测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 回收率试验结果(n=9)

稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液，分别于 1，2，3，5，10，20，30 h时进样测定。结果峰面积的 RSD为1.1%（n=7），表明供试品溶液在30 h内稳定。

重现性试验：对同一批（批号为20060601）样品6份，依法测定。结果峰面积的 RSD为0.3%（n=6），表明方法重现性好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液，重复进样5次，测定峰面积，计算进样精密度，结果的 RSD为1.0%。以不同试验人、不同仪器对同一对照品及同一批（批号为20060601）样品6份进行测定。结果的 RSD均小于2%，表明中间精密度良好。

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法测定含量，并与药典中紫外分光光度法（UV法）[3]测定结果进行比较。结果见表2。可见，这两种方法均可准确测定本品的含量，准确度良好。由于HPLC法准确度更高，因此最终采用其作为本品的含量测定方法。

表2 样品含量测定结果

3 讨论

取利塞膦酸钠对照品适量，溶于流动相中,在紫外可见分光光度计上于200～400 nm波长范围内扫描,结果在262 nm波长处有最大吸收。

利塞膦酸钠分子结构中含有的亲水基团较多，疏水基团较少,这就使得其在反相固定相上保留较弱、出峰较快；另外，由于两个磷酸根基团在水溶液中均可发生解离，因此在流动相中利塞膦酸钠实际上是以游离态和解离态多种形式存在，这是造成利塞膦酸钠色谱峰形拖尾的原因之一。

由于利塞膦酸钠在流动相中主要以阴离子的形式存在，因此采用与呈阳离子的离子对试剂形成离子对的方法，可以延长利塞膦酸钠的出峰时间。参考文献[1]选用溴化铵类试剂。试验中发现，当色谱系统的其他条件一定时，利塞膦酸钠的保留时间与离子对试剂的烃基链长呈正相关,即四乙基溴化铵对出峰时间的影响最小,四丁基溴化铵的影响适中,而十八烷基三甲基溴化铵的影响最大，最终选择四丁基溴化铵作为色谱系统的离子对试剂。

文献[3]中曾采用聚合物固定相、将流动相pH调至11～12来改善双膦酸盐类药物的色谱峰形。本试验考察了反相色谱柱在其耐受的pH范围(即pH 2～8)条件下，利塞膦酸钠色谱峰形与流动相pH之间的关系，发现流动相pH的提高对色谱峰形的改善作用并不明显。利塞膦酸钠与金属离子有较强的络合作用[4－5]。在试验中发现，当向流动相中加入少量络合剂乙二胺四乙酸二钠时,色谱峰形可得到明显改善。这可能与乙二胺四乙酸二钠能减弱固定相上痕量金属离子与利塞膦酸钠的络合作用有关。

[1]郝卫强,刘文英，狄 斌，等.高效液相色谱法测定利塞膦酸钠片的含量[J]. 中国药科大学学报，2001，32（4）：286 －289.

[2]Sir is ES,Chines AA,Altman RD,et al.Risedronate in the treatment of Paget′s disease of bone：an open label,m9lticenter st9dy[J].J B one Miner Res,1998,13(6)：1 032 － 1 038.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社,2005：附录191－193.

[4]Us9i T,Kawakami R,Watanabe T,et al.Sensitive determination of a novel bisphosphonate,YM 529,in plasma,9rine and bone by high performance liq-9id chromatography with fl9orescence detection[J].J Chromatogr B,1994,652(1)：67－72.

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Determination of Sodium Risedronate by HPLC

Wan Weixiang,Qu Jianjiang
（Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou,Jiangsu,China 225300）

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of sodium risedronate.MethodsThe analysis was achieved by using Hanbang C18column with the buffer solution－ methanol(75∶25,v/v)as the mobile phase.The buffer solution was prepared by dissolving 5 mmol/L ammonium dihydrogen phosphate,2 mmol/L tetrabutyl ammonium bromide,1.5 mmol/L disodium ethylenediamine tetraacetic acid and adjusted to pH=7.2 with sodium hydroxide.The detection wavelength was at 262 nm,the velocity was 1 mL/min.ResultsThe sample was not interfered with materials and intermediates.The linear range was 4.2－37.8!g/mL(r=1.000 0).The average recovery rate was 100.5%,RSD=1.1%(n=9).ConclusionThis method can be used to assay the sodium risedronate.

sodium risedronate;content;HPLC

R927.2；R982

A

1006－4931(2010)04－0024－02

2009－09－02)