浙江省鼠形动物巴尔通体的遗传进化分析＊

孙继民,宋秀平,傅桂明,鲁 亮,刘起勇

浙江省鼠形动物巴尔通体的遗传进化分析＊

孙继民1,2,宋秀平1,傅桂明2,鲁 亮1,刘起勇1

目的 分析浙江省鼠形动物中巴尔通体分子遗传进化关系,为巴尔通体人群感染的预防控制提供科学依据。方法用夹夜法在浙江省不同地区、不同季节捕获鼠形动物,无菌操作取鼠肝和脾,用PCR和分离培养检测巴尔通体,对部分阳性产物测序,提交到 GenBank,用CLUSTAL W进行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10软件构建系统关系,分析其遗传进化关系。结果我们分别从黑线姬鼠、黄毛鼠、褐家鼠、黑腹绒鼠、社鼠、臭鼩鼱、东方田鼠、黄胸鼠和大林姬鼠中检测到巴尔通体特异DNA片段,浙江首次从黑线姬鼠脾中分离出一株巴尔通体。遗传进化分析显示我们检测到的巴尔通体与Bartonella rattim assiliensis以及对人类有致病性的B.graham ii的遗传关系最近。结论浙江省鼠类中广泛存在巴尔通体感染,而且携带人类致病性巴尔通体,存在人群感染风险。

鼠形动物;巴尔通体;遗传进化分析

巴尔通体是一类革兰氏阴性菌,可侵袭宿主的红细胞和内皮细胞〔1〕,目前巴尔通体包括21个种及亚种,其中至少12种已知可致人类疾病〔2〕。这类细菌的致病谱非常广,五日热巴尔通体(Bartonella quintana)可引起战壕热、心内膜炎、杆菌性血管瘤〔3〕和流浪人群的菌血症〔4〕;汉赛巴尔通体 (B.henselae)可以导致杆菌性血管瘤〔5-6〕和心内膜炎〔7-8〕以及最常见的猫抓病〔9-10〕;杆菌状巴尔通体可以引起秘鲁疣(verruga peruana)和奥罗亚热(Oroya fever)〔11〕,近年来 B.vinsonii Sub sparupensis〔12〕和B.tam iae等数种巴尔通体也先后被报导可对人类致病。

据临床报道,浙江省猫抓病病例数在国内仅次于江苏,据第二位,而且浙江省经济发达,风景优美,有众多的商贸中心和旅游景点。然而,目前尚没有从浙江地区分离出巴尔通体的报导,我们也不清楚鼠类的感染情况以及所携带巴尔通体是否可对人类致病。所以有必要对浙江省鼠类中巴尔通体感染情况进行调查,并弄清其所携带巴尔通体的种类可对人类致病,为保障人类健康提供依据。

1 材料和方法

1.1 样本采集 2005年12月至2006年12月,分别在天台、金东、龙泉、临海、淳安、上虞、龙游、瓯海、建德和江山等10个县区的丘陵、山区、农场、区民区等生境用夹夜法捕获鼠形动物,所有的鼠形动物分类鉴定,然后无菌操作取肝和脾,置于1.5m L灭菌离心管中,-20℃保存。记录每只鼠形动物的背景资料,包括编号、采集时间、地点、生境、鼠种、雌雄、体重、头体长、尾长、耳高等背景资料。

1.2 分离培养 随机选取10份样本进行分离培养,每份样本取25mg鼠形动物的肝脾用研钵研碎,然后加入200μL灭菌胰酶大豆肉汤研成匀浆,接种于含5%脱纤维羊血的胰酶大豆琼脂培养基上,至于含5%CO2、37℃培养箱中,每天观察其生长情况并记录,最长达45d。为预防交叉感染,每只动物的标本单独用一个研钵,研钵用后高压灭菌后清洗。

1.3 DNA提取

1.3.1 脏器DNA提取 将脏器研磨后,采用Q IAGEN核酸提取试剂盒,将按照说明书逐步提取DNA。

1.3.2 菌落DNA提取 挑取疑似且革兰染色镜下见阴性小杆菌的菌落,收集于含100μL去离子水(p H 8.0)的1.5 mL离心管中,混匀,100℃煮10 min,50 000 r/min离心5 min,上清液即为模板,制成模板后,-20℃保存备用。

1.4 PCR及电泳检测 反应体系25μL,模板DNA加3μL,10μmol/L引物1μL,Taq DNA 聚合酶1.5 U,10 ×buffer 2.5μL,20 mmol/L M g2+1.5μL,2.5 mmol/L dNTP 2μL,加去离子水至25μL,反应使用PTC2150型DNA仪(MJ Research Inc,Watertow n,MA),反应用引物见表1。取5μL扩增产物,加入1μL电泳载样液,1%琼脂糖电泳(4 V/cm)40 min,紫外灯下观察并拍照。

为避免标本污染引起假阳性反应,标本处理、反应液制备、PCR扩增以及产物分析在不同区域进行,加样器和移液器分开专用,PCR反应同时设立阳性对照和空白对照(去离子水)。两对引物扩增产物均阳性判为阳性,如果只有一对为阳性则判为阴性。

表1 PCR反应引物Tab.1 Sequnences of primers

1.5 PCR阳性产物克隆及测序 gltA基因巴尔通体的遗传学分类标志〔5〕,为进一步鉴定所检测到的DNA序列,我们选取8例 PCR检测阳性和1例分离菌株的gltA引物扩增产物用Promega的纯化试剂盒纯化,然后按照厂家说明书用p GEM-T Easy载体克隆。挑取白色菌落由六合通公司进行测序,预计测序产物长度为379bp。

1.6 序列比对及数据分析 将所得序列与 Gen-Bank中记录的巴尔通体种类的相同基因进行进化关系分析,所有序列数据用CLUSTAL W进行匹配,然后用PAUP 4.0 beta 10软件构建系统关系,分析方法为最大简约法。以布鲁氏菌(Brucella abortus)作为外群。

2 结 果

2.1 捕获动物情况 全省共捕获427只动物,捕获数最多的是天台229只,其次是龙泉76只,其余地区均低于50只。所捕获鼠形动物的种类包括192只黑线姬鼠、28只社鼠、45只黄毛鼠、27只鼩鼱、7只黄胸鼠、43只褐家鼠、9只小家鼠、37只黑腹绒鼠、9只东方田鼠、23只臭鼩鼱和7只大林姬鼠。雌性230只,雄性197只。

2.2 分离培养结果 从选取的10份样本中分离出1株巴尔通体,该样本来自天台的一只黑线姬鼠。

2.3 PCR检测结果 共检测出134份阳性,其中阳性率最高的县区是临海为56.3%,龙游和瓯海也达到40%,样本量最多的天台阳性率为37.1%。检测阳性的鼠种包括黑线姬鼠、社鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠、黑腹绒鼠、东方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠,我们没能在鼩鼱和小家鼠中检测到阳性。雌性的阳性率为30.9%,雄性的阳性率为32%。

2.4 测序结果 8例PCR扩增阳性产物经测序后提交到 GenBank后的注册号分别为 EU 179229、EU 179230、 EU 179231、EU 179232、 EU 179233、EU 179234 、EU179235和 EU 179236。

2.5 遗传进化分析 根据gltA基因的进化分析,我们测得的序列聚为两个群,但这两个群之间的相似度大于 98%,这两个群与 B.graham ii和 B.Rattimassiliensis的遗传关系最近(图1)。第一个群中,R29ZJ、R60ZJ、R17ZJB、R2ZJJD 和 R3ZJJD的序列完全一致,并且与Ac1692yn(A F391271)、Ad1734yn(AF391278)和 A l1714yn(AF391280)的相似度达到99%,这几个序列分别来自云南的西南姬鼠,、龙姬鼠和四川姬鼠 (Bai et al.,2002)。R21ZJ和R66ZJB的序列仅有一个碱基不用,R21ZJ第131位为T,R66ZJB相应位置为C,R1ZJB的序列与 R21ZJ也仅在338位有一个不同(C→T),这三个序列与美国西部白腹食蝗鼠血中检测到的巴尔通体菌株 OL 11554ks(DQ 357612)相似度大于95%(Ying Bai et al.,2007),他们与 B.graham ii(A Y584855)的相似度为96%(图1)。

图1 巴尔通体遗传进化分析图Fig.1 Phylogenctlc anahysis of Bartonellassp

3 讨 论

巴尔通体宿主动物广泛,除了猫、犬和牛等与人类关系密切的动物外,野生鼠形动物也是巴尔通体的重要自然宿主,是巴尔通体最大的贮存宿主。调查显示英格兰和美国东南部鼠形动物的巴尔通体感染率分别为 62.2%(23/37)和 42.7%(119/279)〔13-14〕。据我们所知,目前检测到巴尔通体的鼠形动物至少包括褐家鼠、黄胸鼠、屋顶鼠、小家鼠、大林姬鼠、日本姬鼠、黄喉姬鼠、小林姬鼠、黑线姬鼠、欧鼠、田鼠、拉布拉多白足鼠、小花鼠、金背黄鼠、加州黄鼠、细足林鼠、白喉林鼠、Sorex vulgaris、鼩鼱、大绒鼠、斯氏家鼠、锡金小鼠、灰麝鼩、大足鼠和臭鼩鼱等〔15-23〕。目前已经有多种巴尔通体从小型兽类中分离出,例如 B.tribocorum,伊丽莎白巴尔通体 ,B.graham ii、B.tay lorii、B.vinsonii vinsonii、B.w ashoensis、B.doshiae、B.birtlesii、B.vinsonii arupensis、 B. rattimassiliensis、 B.Phoceensis等〔24〕。

我们检测到的巴尔通体与B.Rattim assiliensis的遗传关系最近,但更重要的是它们与人类致病性巴尔通体B.graham ii的遗传关系也非常近。这就提示我们浙江省鼠形动物所携带的巴尔通体可以对人类致病,存在感染人的风险。

在本研究中,我们从黑线姬鼠、社鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、褐家鼠、黑腹绒鼠、东方田鼠、臭鼩鼱和大林姬鼠中检测到了巴尔通体,从黑线姬鼠的样本中分离出一株巴尔通体,这是首次从浙江的样本中分离出巴尔通体,对浙江省巴尔通体的研究奠定了基础。

综上所述,我们从浙江省不同地区不同鼠种的样本中均检测到了巴尔通体,根据遗传进化分析所检测到的巴尔通体与B.graham ii和B.Rattim assiliensis的遗传关系最近,首次从浙江分离出巴尔通体,为浙江省巴尔通体的预防控制提供了科学依据。

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Phylogenetic analysis of Ba rtonella spp.from rodents of Zhejiang Province

(State Key Laboratory for Infectious Disease Control and Prevention,National Institute for Infectious Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

SUN Ji-min,SONG Xiu-ping,FU Gui-ming,LU Liang,L IU Qi-yong

To identify Bartonella spp.from rodents of Zhejiang Province and provide scientific basis for the control and prevention of Bartonella infection in human,murine-like animals were cap tured by night trapping method and their liver and spleen were collected to detect Bartonella by PCR and isolating culturemethod.Part of positive amp liconswere sequenced and submitted to GenBank and phylogenetic analysis was performed by comparison of g ltA fragments with PAUP 4.0 beta 10.Bartonella DNA was detected in 46.9%Samp les of A podemus agrarius,Rattus losea,Rattus norvegicus,Eothenom ysmelanogaster,Niviventer confucianus,Suncusm urinus,M icrotus fortis,Rattus flavi pectus,and Apodem us speciosus.Furthermore,the first Bartonella spp.was isolated from Apodem us agrarius in Zhejiang Province in this study.Phylogenetic analysis showed that the sequenceswere similar to Bartonella rattimassiliensis and Bartonella graham ii.It’s concluded that there exists Bartonella spp.,which could infect human,in small rodents of Zhejiang Province.

murine-like animal;Bartonella spp.;phylogenetic analysis

R376

A

1002-2694(2010)06-0532-03

＊国家自然科学基金(30371246)

刘起勇,Email:liuqiyong@icdc.cn

1.中国疾病预防控制中心,传染病预防控制所;传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206;2.浙江省疾病预防控制中心,杭州 310051

2009-11-26;

2009-11-28