人类wnt9a的免疫组化研究

向 阳, 刘高荣, 戴 应, 王 洁

(湖南理工学院 化学化工学院, 湖南 岳阳 414006)

乳腺癌是发生在乳腺上皮组织的恶性肿瘤, 其发病率占女性恶性肿瘤首位[1], 是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一. 近年来, 无论在基础研究、发病机理, 还是临床早期诊断和防治上都取得很大的进展. wnt基因是一类癌基因, wnt蛋白是一类从水螅到人类都广泛存在、分泌性、经过脂质性修饰的信号蛋白[2], 在动物发育过程中具有广泛的作用. 哺乳动物基因组中存在19个wnt基因,其功能具多样性, 突变导致发育的畸变: 从干细胞的丢失到肾和生殖域的缺失[3]. wnt蛋白通过自分泌或旁分泌作用与位于细胞膜上的受体相结合, 激活细胞内信号通路, 调节靶基因的表达; 在胚胎发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡均起到重要的作用. wnt信号通路的异常激活往往与肿瘤的发生相关联[4]. 通过wnt基因及信号通路来研究乳腺癌的发病机制及原理对乳腺癌的防治具有重要意义.RT-PCR和免疫组化研究结果表明人类wnt9a基因和wnt9a蛋白在人类乳腺癌MCF-7细胞中均表达, 本研究为进一步研究wnt9a在乳腺癌发生和防治中的作用奠定了一定基础.

1 材料和方法

1.1 工具酶、抗体、试剂盒及寡核昔酸引物合成

DNA聚合酶购于Clontech 公司(San Jose, USA); RNA分离试剂盒是Gentra公司的产品(Minneaplis,USA); Revertaid TM逆转录试剂盒购于Fermentas公司 (MBI, Lithuanian); 鼠抗wnt9a多克隆抗体, 针对人羧基端302-315位氨基酸残基和鼠298-313位氨基酸残基, 人鼠通用, 订购于武汉博士德公司; 荧光素标记羊抗鼠多克隆抗体(02-18-06)购自欧洲KPL公司. wnt9a基因检测引物(696bp)5′-tcaaggagactgccttcctctat-3′和5′-actccacatagcagcaccaac-3′由上海英俊公司合成.

1.2 MCF-7细胞培养、RNA分离及RT-PCR分析

人类乳腺癌MCF-7细胞的培养基为RPMI-1640培养基, 添加10%的胎牛血清(FCS)和1%的抗生素. 在细胞培养箱中 37℃, 5%的CO2条件下培养. 每天换液一次, 2天传代一次. 将培养好的MCF-7细胞置于DEPC处理过的 1.5mL EP管中, 并将EP管置于冰上, 根据Gentra RNA抽提试剂盒(Gentra, 美国)提供的操作说明抽提人类乳腺癌MCF-7细胞总RNA, 置于－80℃低温冰箱保存. 根据逆转录试剂盒操作说明分别以MCF-7细胞RNA为模板合成cDNA第一条链, 然后以cDNA第一条链为模板进行PCR扩增反应. 扩增反应是在PE 9600PCR仪上进行, 条件是: 在95℃变性60秒; 然后在94℃下变性30秒, 55℃下退火30秒,72℃下延伸30秒, 共35个循环; 最后在72℃下反应10分钟, 待温度降为4℃时从PCR仪上取出产物, 然后在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳.

1.3 免疫组化过程

MCF-7细胞培养好后去掉培养液, 用PBS洗3次然后固定. 固定液为含1/1000 DEPC的1%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0～7.6), 室温 10 min, 0.5MPBS洗 3次, 每次 5 min. 蒸馏水新鲜配置 3%H2O2, 室温5～10min以灭活内源性酶. 蒸馏水洗 3次. 微波修复抗原: 将切片浸入 0.01M 枸橼酸盐缓冲液(pH6.0),电炉或微波炉加热至沸腾后断电, 间隔 5～10min, 反复 2～3次. 冷却后进行下一步实验. 对于难以显示的抗原, 可用抗原修复液Ⅰ进一步暴露抗原, 滴加在切片上室温20min后, 0.1M PBS洗涤2～3次. 滴加正常血清封闭液, 室温20min. 甩去多余液体, 不洗. 滴加适当稀释的一抗(鼠lgG), 3730℃～60min, 0.01M PBS洗2min×3次. 滴加荧光素标记的羊抗鼠二抗, 20～37℃, 20min. 0.01M PBS洗2min×3次. 荧光显微镜观察, 照相[5].

2 结果

2.1 wnt9a基因在MCF-7中表达的检测

采用RT-PCR的方法检测人类wnt9a基因在乳腺癌MCF-7细胞中的表达, PCR产物大小与引物设计的相符(图1)产物长度为696bp. PCR产物直接送上海英俊公司测序, 测序结果正确.

2.2 人类wnt9a在人乳腺癌MCF-7细胞的免疫组化研究

进一步检测人类wnt9a蛋白在MCF-7细胞中的表达情况, 我们进行了免疫组化研究, 结果显示: 人类wnt9a蛋白在在MCF-7细胞中表达(红色荧光)(图2), 为wnt9a的进一步研究打下了基础.

图1 从MCF-7细胞cDNA扩增人类wnt9a基因

图2 人类wnt9a在MCF-7细胞中表达的免疫组化检测(X400)

3 讨论

乳腺癌是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤, 近年来, 采用基因治疗研究乳腺癌的防治是一个热门领域. 很显然, 乳腺癌的发生与基因及表达调控息息相关, wnt基因是一类癌基因, wnt信号通路的异常激活往往与肿瘤的发生相关. 本文设计了wnt9a的检测引物, RT-PCR结果表明wnt9a在人类乳腺癌 MCF-7细胞中表达. 同时, 免疫组化实验结果表明人类 wnt9a蛋白在人类乳腺癌MCF-7细胞中表达. 本研究为进一步研究wnt9a在乳腺癌发生和防治中的作用奠定了一定基础.

[1]张丽军, 谭丁桃. 乳腺癌蛋白质组研究进展[J]. 生命科学, 2007, 19(5): 512～517

[2]Willert K, Brown J D, Danenberg E, et al. Wnt Proteins Arelipid-modified and Can Act as Stem Cell Growth Factors[J]. Nature, 2003, 423 (6938):448～452

[3]K. Cadigan, R. Nusse, Genes Dev. 1997,11

[4]Miller JR. The Wnts [J]. Genome Biol, 2002, 3(3001):123001～15

[5]Y . XIANG, D . S . NIE , G . X . L U . Cloning of a Novel Gene, Cymg1, Related to Family 2 Cystatins and Expressed at Specific Stages of Mouse Testis Development [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(1): 11～18