犬肝脏中戊型肝炎病毒抗原的检测及组织病理学观察

李睿文,周 寅,佘锐萍*,李丰昌,尹 君,毛晶晶,孙 泉

(1.中国农业大学动物医学院,北京 100094;2.河北农业大学中兽医学院,河北定州 073000;3.北京永昌动物医院,北京 100000)

犬肝脏中戊型肝炎病毒抗原的检测及组织病理学观察

李睿文1,2,周 寅1,佘锐萍1*,李丰昌3,尹 君1,毛晶晶1,孙 泉1

(1.中国农业大学动物医学院,北京 100094;2.河北农业大学中兽医学院,河北定州 073000;3.北京永昌动物医院,北京 100000)

为探讨宠物犬戊型肝炎病毒(HEV)的感染情况,试验采集了21例宠物犬肝脏,采用免疫组织化学染色方法对上述肝脏组织中的HEV-Ag进行了检测,同时应用H.E染色和M allory三染色法对其病理形态学变化进行了观察。结果表明在21例宠物犬肝脏中均检出了HEV抗原。组织病理学观察可见肝脏有明显的炎症变化。提示宠物犬感染HEV程度很高,并且是人感染HEV潜在传染源,具有重要的公共卫生意义。

宠物犬;戊型肝炎;免疫组织化学;组织病理学

戊型肝炎是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性病毒性疾病,主要通过粪-口途径传播[1]。戊型肝炎以其水源性暴发流行和急性散发为特点,呈全球分布,流行地区主要为发展中国家,在发达国家的发病率呈散发状态。历史上先后在东南亚、中亚、中东、北非和西非以及墨西哥等国发生50余次疫情[2-3]。中国是戊肝的高发地区,迄今为止已暴发11次,其中以1986年-1988年我国新疆南部地区发生戊型肝炎水型流行最为严重,共计发病119 280例,死亡707例,是迄今世界上最大的一次戊型肝炎流行,造成了巨大的社会危害和经济损失[4]。人群感染后死亡率在0.5%～3%之间,孕妇感染病情较重,病死率高达5%～25%。

自1997年Meng等人分离到第一株动物HEV毒株——猪HEV[5],现已证实非人灵长类动物猪、鹿、牛、羊、犬猫以及鱼可感染HEV[6-10],因此认为戊型肝炎是一种人畜共患疾病,但是动物在戊型肝炎的传播中起何作用现还不是十分清楚。据报道上海地区犬血清中HEV-IgG阳性率为17.82%和21.40%[11-12],福建地区犬血清中HEV-IgG阳性率为38.78%,青海地区犬血清中HEV-IgG阳性率为50%以上。上述证据表明犬可能感染HEV,但至今为止还没有从犬分离到HEV。近年来.宠物行业作为新兴都市化产业已见雏形,并且得到了较快的发展。其中宠物犬的饲养数量位居宠物第一位,人与宠物犬的关系越来越密切.与宠物犬接触的人群数量越来越大,但有关宠物犬感染HEV后肝脏中抗原(HEV-Ag)分布及其对肝脏的病理损伤还未见报道。为初步探讨宠物犬HEV的感染情况,本研究通过对宠物犬肝脏进行免疫组织化学染色、HE染色和M allory三色染色,统计宠物犬肝脏内戊型肝炎相关抗原的阳性率,以及戊型肝炎病毒感染对肝脏造成的病理损伤等,为深入研究HEV提供流行病学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 宠物犬肝脏的来源 21份肝脏组织由北京市多家动物医院提供,多聚甲醛-戊二醛混合固定液中固定,犬源为宠物犬,生前状况不完全清楚。

1.1.2 试剂 兔抗人HEV多克隆抗体(一抗)、二抗及其他免疫组化试剂均购自北京博奥森生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病理组织切片制作和免疫组织化学染色按常规石蜡切片制作技术连续切片,分别进行HEV免疫组织化学染色、苏木素-伊红染色及M allory三色染色法。苏木素-伊红染色和M allory三色染色法按常规方法进行,免疫组织化学染色方法按试剂操作说明书进行。阴性染色对照不加一抗。

1.2.2 免疫组织化学染色结果的判定 在显微镜下,HEV免疫组织化学染色阳性反应信号为棕红色或棕黄色团块状或颗粒状。

2 结果

2.1 犬肝脏中HEV-Ag免疫组化检测结果

肝脏组织HEV免疫组化检测结果见表1。由表1可见,21例肝脏组织HEV免疫组化检测阳性率为100%。虽然犬肝脏中HEV-Ag免疫组织化学阳性检出率为100%,但犬肝脏组织内HEV-Ag免疫组织化学阳性反应信号的强弱不尽相同,其中强阳性的有13例,占被检样品总数的61.90%;中等阳性的有6例,占总数的28.57%;弱阳性的有2例,占总数的9.52%。

表1 犬肝脏中HEV-Ag免疫组化检测结果Table 1 The results of detection of HEV-Ag by immunohistochem icalmethod in pet dogs'liver|

2.2 犬肝脏中HEV-Ag的分布定位

HEV-A g免疫组织化学阳性反应信号呈颗粒状弥散于肝细胞胞浆内,或胞核(图1A)。免疫组织化学观察结果发现,在HEV-Ag呈阳性反应的肝脏具有相同的特征,即位于肝被膜附近的肝组织中,阳性反应信号散在分布,常常仅见肝细胞核呈明显的阳性反应,胞浆多呈阴性反应;远离被膜的肝组织,阳性反应信号常成片分布,胞浆多呈阳性反应,而胞核却较少呈阳性反应。有时,在一个双核的肝细胞内常可一个核呈阳性反应,另一个呈阴性反应。在肝小叶的周边区,阳性反应信号常散在分布,且常出现于核内。间质淋巴细胞呈阴性反应(图1B)。汇管区的小叶间动脉和静脉的内皮细胞及小叶间胆管上皮细胞均呈阳性反应。在不加一抗的阴性染色对照片未见任何阳性反应信号(图1C)。

2.3 HEV-Ag免疫组化检测阳性肝脏病理组织学观察

光镜观察发现,所观察的21例肝脏组织均有不同程度的病理变化。常见淋巴细胞等炎性细胞浸润(图2A),肝脏细胞气球样变,散在的核固缩性坏死细胞(图2B),汇管区胆管增生,纤维结缔组织增生等(图 2C)。

21例肝脏组织病理学变化分类统计结果见表2。由表2可以看出,100%的肝脏出现了肝细胞变性,85.71%的肝脏肝细胞发生单个核固缩性坏死,28.57%肝脏中出现局限性坏死灶,100%的肝组织中见有淋巴细胞等炎性细胞浸润,71.43%的肝脏汇管区有胆管增生。

图1 犬肝脏中HEV-Ag显示,阳性信号为棕黄色颗粒,A、B为HEV阳性肝脏,C为HEV阴性对照,染色过程中不加一抗,40×Fig.1 HEV antigen was detected in the hepatocytes from naturally in fected pet dogs.Immunoh istochemistry,Brown substrate,haematoxylin coun terstain(40×)

图2 犬肝脏HEV免疫组化阳性肝组织的H.E.染色切片观察,40×Fig.2 The H istopathologic observation on positive livers from pet dogs,hematox ylin-eosin staining,40×

表2 21例肝脏组织病理学变化分类统计Table 2 The resu lts of Pathological changes in 21 livers from pet dogs

2.4 M allory三色染色法染色观察

M allory三色染色法染色结果表明,在21例犬肝脏中,镜检发现71.43%(15/21)的肝组织中纤维结缔组织增生,并且发现纤维组织随炎症反应伸入肝小叶,并见有网状纤维胶原化的趋势(图3)。

图3 犬肝脏组织的Mallory三染色切片观察,20×Fig.3 The H istopathologic observation on positive livers from pet dogs,Mallory staining,20×

3 讨论

戊型肝炎是一种人畜共患疾病,已从多种动物分离到HEV,虽然有资料表明宠物犬血清中存在HEV-IgG,提示宠物犬也可感染HEV,但是还未见从宠物犬分离到毒株[13-14]。据Renou C等报道[15],在法国,HE病人可能是由其宠物猪感染所引起的,Kuno在调查一急性戊型肝炎患者的病史时发现,和病人住在一起的家庭成员HEV IgG、IgM呈阴性,而他的宠物猫IgG却为阳性[16]。宠物与人类接触密切,提示宠物可能是散发性 HE的潜在传染源。而宠物犬,作为一种常见的人类伴侣动物,其疾病的控制不仅关系到动物本身的健康,而且会影响到人类的健康。

本试验用抗人HEV的抗体,应用免疫组织化学方法检测宠物犬肝脏中戊型肝炎病毒抗原,结果发现21例宠物犬肝脏中发现HEV Ag强阳性率为61.90%,一般阳性率为 28.57%,弱阳性率为9.52%,总阳性率为100%,表明在宠物犬中HEV的感染非常普遍。本研究对北京地区的宠物犬肝脏的HEV抗原检测结果分析发现,由于宠物犬肝脏的来源于北京多家动物医院,犬源多为宠物犬,与人类接触密切,很可能是人与犬在日常生活中互相传播感染HEV;并且试验中采用的一抗为兔抗-人HEV抗体,在犬肝脏中检测出了如此高的HEV抗原,表明宠物犬的HEV和人的 HEV有很大的相关性。这又为戊型肝炎的跨种间传播和其人畜共患性提供了有力的证据。

人感染HEV后表现为急性肝炎症状,一般起病急,黄疸多见。感染HEV的病理变化主要为肝细胞气球样变,嗜酸性变、灶状坏死及淋巴细胞、单核细胞浸润[17]。电镜检查,肝细胞肿胀,内质网扩张,线粒体形态异常,糖原减少,HEV颗粒散在于胞浆基质中。猪感染HEV后,免疫组化阳性信号及病变与人基本一致[18]。研究对21例HEV免疫组化阳性反应肝组织的病理学观察,发现所有肝组织中见有淋巴细胞等炎性细胞浸润、肝细胞变性,85.71%的肝脏出现了散在单个核固缩性坏死,接近72%的肝脏出现肝窦、狄氏隙扩张,90.48%的肝脏汇管区胆管和纤维结缔组织增生。免疫组化阳性的宠物犬肝脏的Mallory三色染色结果显示肝组织中纤维结缔组织增生,并且发现纤维组织随炎症反应伸入肝小叶,有网状纤维胶原化的趋势。本研究中组织病理学的观察结果与人的HE的病理变化基本一致。结果表明HEV的感染对肝脏造成了明显的损伤作用,表现有纤维化的趋势。但HEV如何对肝脏组织造成损伤的具体机理还需进一步研究。

综上所述,HEV在宠物犬中感染程度非常高,而且组织病理学观察结果表明宠物犬感染HEV后对肝脏的损伤与人的基本一致,这些表明宠物犬可能是人感染HEV潜在传染源。家养动物与人类接触密切,有将HEV传播给人的机会,其排泄的粪便更有污染水源的可能,尤其是宠物犬感染HEV后常表现为亚临床状态,不易引起人们的注意,因此更具有传播戊型肝炎的潜在危险性。所以,应加强对宠物犬感染HEV的监测,以更好地防止戊型肝炎的蔓延。

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Detection of the Hepatitis E Virus(HEV)Antigen and Histopathologic Observation in Liver of Pet Dog

Li Rui-wen1,2,ZHOU Yin1,SHE Rui-ping1,YIN Jun1,MAO Jing-jing1,SUN Quan1

(1.College of Veterinary M edicine,China Agr iculture University,Beij ing,100094,China;2.Collegeof T rad itional
Veterinary M ed icine,H ebei Agricu ltura l University,Dingzhou,072000,Ch ina;3.Yong chang Pet H osp ital of Beijing,100000,China)

In order to invest the prevalence of HEV in pet dogs,21 liversof dogwere collected to detect the hepatitis E virus(HEV)antigen by imm unohistochem icalm ethod,and observe pathological changes o f dog's liver by HE staining and Mallory's staining.The results show that 21 livers of pet dogmay be detected HEV-Ag,and positive ratew as 100%;and the histopathologic changes of the livers of pet dog consistent w ith the pathologic changes of liver o f human that in fected HEV.It can be seen that the p revalence o f HEV is high degree in pet dogs.The pet dogs infected HEV Is a potential source to infect human,and it is isignificancem t in pub lic health.

pet dog;hepatitis E virus;immunohistochemicalmethod;histopathology

S852.31

A

1007-5038(2010)04-0058-05

2010-04-06

国家自然科学基金资助项目(项目编号:30871853)

李睿文(1976-),男,河北易县人,在读博士,主要从事人畜共患疾病研究。*通讯作者