泽兰饮片及不同部位HPLC指纹图谱研究

陈慕媛， 黄月纯， 刘东辉， 魏 刚， 刘翠玲

(1.广州中医药大学，广东广州510405;2.广州中医药大学第一附属医院，广东广州510405)

双柏散是广州中医药大学用于外科、骨伤科的经验方，由大黄、侧柏叶、黄柏、泽兰、薄荷五味药组成，常用比例为2∶2∶1∶1∶1，具有活血化瘀、清热解毒、消肿止痛等功效，用于治疗跌打损伤早期、急性软组织损伤、急性踝关节扭伤、疮疡肿毒等有显著疗效［1］。方中泽兰具有显著的改善血液流变性质，同时还具备抗凝血、抑制血小板聚集、改善微循环、保护修复人微血管内皮细胞抑制氧化损伤等作用，其中有效成分咖啡酸发挥着抑制血小板聚集、抗菌消炎等作用［2］。泽兰主要含黄酮类、酚酸类、挥发油等有效成分，目前泽兰的质量研究主要是咖啡酸等酚酸类成分的含量测定［3-4］，尚未见采用指纹图谱技术控制泽兰药材质量的报道。因此，为探讨双柏制剂的化学物质基础和提高质量控制水平，本研究拟采用HPLC法研究泽兰饮片指纹图谱。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪(Agilent HP-1100)，光二极管阵列检测器(DAD);色谱柱:Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);12批泽兰药材饮片分别购自广东六家药材公司(见表1)，经广州中医药大学第一附属医院黄月纯主任中药师鉴定系泽兰Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel的干燥地上部分;咖啡酸对照品(批号110885-200102，含量测定用)，购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯，试验用水为纯化水。

表1 泽兰饮片来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Zorbax Esclipe XDB C18(250 mm×46 mm，5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱:0～20 min乙腈由13%变为25%，20～40 min乙腈由25%变为38%，40～50 min乙腈由38%变为70%，50～60 min乙腈由70%变为95%;检测波长:330 nm;柱温:40℃;流速:1.0 mL/min。

2.2 供试品溶液的制备 称取泽兰粉末1 g于100 mL的鸡心瓶中，加入80%甲醇40 mL，水浴回流1.5 h，取出，放冷，滤过，药渣及滤纸剪碎同置于鸡心瓶中，加40%甲醇40 mL，水浴回流1.5 h，取出，放冷，滤过，用40%甲醇洗涤药渣及滤纸，合并滤液和洗液，蒸干，加80%甲醇适量溶解，离心(4 000 r/min，5 min)，取上清液于5 mL量瓶中，沉淀加80%甲醇洗涤，取上清液并入量瓶中，加80%甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3 精密度试验 吸取供试品溶液10 μL，连续进样6次。结果表明:18个共有峰的相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，提示精密度良好。

2.4 稳定性试验 取供试品溶液10 μL，分别在0，2，4，6，8，12，24 h进样。结果表明:18个共有峰的相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3%，提示24 h内供试品溶液稳定性较好。

2.5 重复性试验 取同一批次样品粉末6份，平行操作。结果表明:18个共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于5%，提示重复性良好。

2.6 样品检测 取供试品溶液10 μL，依法检测。

2.7 指纹图谱的建立分析

2.7.1 共有峰的确定 以上12批泽兰HPLC色谱图均有18个共有峰。经二极管阵列检测器的紫外光谱分析，不同批次泽兰所对应的同一共有峰紫外光谱一致，表明泽兰均具有相似主要特征成分。各批样品的共有峰的相对保留时间与相对峰面积见表2，且各共有峰相对含量较稳定，具有指纹图谱特征性，可初步拟定为泽兰的指标成分群。经对照品对照及紫外光谱对照，1号峰为咖啡酸峰，6号峰为泽兰的第一大峰，其峰面积百分含量在19.95% ～41.38%范围内。

表2 12批泽兰样品HPLC指纹图谱分析结果

2.7.2 指纹峰相似度分析 采用国家药典委员会中药指纹图谱相似度软件2004年A版计算均值相似度。以12批泽兰的测定结果拟定泽兰HPLC指纹图谱的共有模式，并以此共有模式为对照计算各批泽兰的相似度，结果见表3。12批泽兰指纹图谱重叠图见图1，12批泽兰生成的共有模式指纹图谱见图2。

表3 12批泽兰HPLC指纹图谱相似度结果

图1 12批泽兰样品HPLC指纹图谱叠加图

图2 12批泽兰样品HPLC指纹图谱共有模式

2.8 不同部位的指纹图谱比较研究 称取泽兰地上部分、茎、叶粉末各1 g，按2.2项下方法制备，按拟定方法进样分析，结果茎具有18个特征指纹峰，叶具有17个特征指纹峰，见表4、表5。全粉、茎与叶的指纹图谱重叠图谱见图3。

表4 4批泽兰饮片及不同部位HPLC指纹图谱分析结果

图3 泽兰不同部位HPLC指纹图谱

3 讨论

经试验优化确定以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱系统为流动相。经采用254、330、350 nm等不同的检测波长检测及用光二极管阵列检测器分析，在330 nm波长处指纹峰较多，多数特征成分的响应值均较大，而且基线较平稳，故选择330 nm作为指纹图谱检测波长。

供试品溶液的制备比较了超声处理和水浴回流两种提取方法，结果水浴回流提取较完全。采用不同浓度的甲醇和乙醇溶液作为提取溶媒，结果甲醇对30 min之后的色谱峰提取效果较好，60% ～80%甲醇对8～30 min之间的色谱峰提取效果较好，40%甲醇对咖啡酸等极性较大的成分提取效果最好;8～30 min的色谱峰总共有峰占总峰面积的81.32%～86.92%，咖啡酸峰面积百分含量在6.07% ～8.05%范围内;而且不同溶媒提取液出峰数基本一致，主要表现为峰面积响应值的不同，综合分析，本试验选择80%甲醇和40%甲醇为提取溶媒。为显示图谱全貌，通过制备不同浓度的供试品溶液进行分析比较，结果供试品溶液为0.2 g/mL生药量，各共有峰的相对含量较稳定，色谱峰响应值较大，故确定供试品溶液的浓度为0.2 g/mL生药量。

表5 4批泽兰不同部位HPLC指纹图谱叶、茎峰面积比值结果

按拟定的方法，测定了12批泽兰样品，共标出18个共有峰，各样品间峰面积相对百分含量具一定特征性，均以1、3、6、13号峰为四强峰，可初步拟订为泽兰特征指纹峰。18个共有峰峰面积的相对含量均较稳定，相似度为0.957～0.999，说明不同来源的泽兰饮片质量相对较稳定。

按已拟定的方法，分析了4批泽兰茎、叶的HPLC指纹图谱，结果茎具有18个特征指纹峰，叶具有17个特征指纹峰，茎、叶均以1、3、6、13号峰为主要特征峰;对同一批样品茎、叶不同部位进行分析，结果表明茎、叶的特征指纹峰相对含量具显著性差异，其中全粉的4号峰仅来源于茎，而且除9、12、15号峰有部分样品的叶峰面积小于茎峰面积外，其它特征指纹峰的叶峰面积均大于茎峰面积，提示泽兰叶所含特征指纹峰成分的含量高于泽兰茎。因此，为保证泽兰药材的质量，建议应规定药材中叶的比例。

［1］魏 刚.双柏散临床应用与研究进展［J］.广州中医药大学学报，1998，15(增刊):60-62.

［2］刘 君.泽兰的化学成分及药理研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(1):23-24.

［3］聂 波，刘 勇，徐 青，等.高效液相色谱法测定不同泽兰中咖啡酸的含量［J］.中国中药杂志，2006，31(11):882-884.

［4］黄宏伟，邹盛勤.反相高效液相色谱法测定泽兰中乌索酸和齐墩果酸的含量［J］.安徽农业科学，2007，35(15):4409，4457.