曲古抑菌素A对神经胶质瘤细胞NOS1基因转录的影响

李英慧，李春义，陈芳杰，赵彦艳

（中国医科大学 基础医学院医学遗传学教研室，沈阳 110001）

曲古抑菌素A对神经胶质瘤细胞NOS1基因转录的影响

李英慧，李春义，陈芳杰，赵彦艳

（中国医科大学 基础医学院医学遗传学教研室，沈阳 110001）

目的 以曲古抑菌素A（TSA）为乙酰化作用因素，研究大鼠神经胶质瘤C6细胞中乙酰化对神经型一氧化氮合酶（NOS1）基因转录水平的影响。方法 应用real-time RT-PCR方法检测C6细胞中NOS1基因mRNA在不同时间及不同浓度TSA作用下表达水平的变化；采用nuclear run-off实验检测TSA作用下NOS1基因转录效率的改变。结果 TSA以时间及浓度依赖方式上调C6细胞中NOS1mRNA水平；NOS1基因转录效率在TSA作用下显著提高。结论 TSA引起的乙酰化使C6细胞中NOS1基因转录水平明显增加。

NOS1；TSA；乙酰化

一氧化氮（nitric oxide，NO）在神经系统中具有多种不同的功能。神经型一氧化氮合酶（NOS1）在神经系统的NO合成中发挥重要作用［1］。NOS1基因转录水平的调节可动态调节NOS1蛋白的表达及NO的合成。蛋白质乙酰化在基因转录调控中发挥重要作用。曲古抑菌素A（TSA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可引起多种蛋白质的乙酰化［2］，从而调节基因表达。本研究以TSA作为刺激因素，探索乙酰化对大鼠神经胶质瘤C6细胞中NOS1基因转录水平的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

C6细胞培养于含15%胎牛血清的DMEM培养基中。37℃，5%CO2及饱和湿度的条件下培养。

1.2 RNA提取及real-time RT-PCR

将细胞随机分为2组，一组用浓度分别为0、2.5、25、250和 2500ng/ml TSA处理 24h，另一组为浓度 250ng/ml TSA分别作用 0、6、12、24及 48h，分别收集2组细胞。应用TRIzol试剂常规方法提取细胞总RNA，采用反转录试剂盒（美国Promega公司）合成cDNA。NOS1引物及Taqman探针序列：上游5′-AGGAGGACGCTGGTGTATTC-3′，下游 5′-ATCTAAGGCGGTTGGTCACT-3′，Taqman 探针：5′Fam-ACCGGTTGTCATCCCTCAGCCT-3′Tamra；同时，βactin作为内参，应用如下引物及探针进行扩增：上游 5′-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3′，下游 5′-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3′，Taqman 探 针 ：5′Fam-CCCTCCATCGTGCACCGCAA-Tamra 3′。PCR在优化的反应条件下进行。采用相对定量方法，每个样品扩增3次，取平均值作为样品的相对表达量。

1.3 Nuclear run-off实验

收集对照及TSA（250ng/ml）刺激24h的C6细胞，裂解细胞。获得的细胞核重悬于甘油贮存液，并立即置于-70°C冻存待用。制备含人NOS1或βactin cDNAs的pMD18-T载体，并用Hind III酶切线性化、0.2mol/LNaOH变性，作为探针交联于尼龙膜上。将制备好的细胞核孵育在含100μCi［α-32P］UTP的反应缓冲液中，30°C，30min，进行体外转录。反应混合物用DNase I及蛋白酶K处理，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得RNA。合成的RNA与尼龙膜45°C杂交48h，2×SSC洗膜3次，放射自显影。以βactin信号为内对照，分析TSA刺激前后NOS1信号强弱变化。

2 结果

2.1 TSA以时间和浓度依赖方式上调C6细胞中NOS1基因mRNA表达

细胞经不同浓度TSA作用24h，NOS1mRNA水平逐渐上升；当细胞经250ng/ml TSA作用不同时间，24hNOS1mRNA达到最高水平 （图1）。因此，TSA引起的乙酰化能够以时间及浓度依赖方式上调NOS1mRNA表达。

2.2 TSA使C6细胞NOS1mRNA转录效率提高

为进一步确定上述NOS1mRNA水平的增加是否由转录效率的提高而引起，我们同时进行了nuclear run-off实验。提取对照组和TSA刺激组的细胞核，在32P标记的UTP存在条件下进行体外转录。新合成的mRNA与含人NOS1或β-actin cDNAs的pMD18-T质粒探针进行杂交。在TSA作用下，βactin的转录无明显改变，而NOS1的转录效率显著提高（图2）。因此，TSA引起的NOS1mRNA表达水平的上调与其转录效率的改变一致。

3 讨论

组蛋白乙酰转移酶（HAT）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC）是调节蛋白质乙酰化水平的两类酶。这两类酶的平衡对于维持蛋白质恰当的乙酰化水平至关重要。一旦平衡破坏将产生异常的蛋白质乙酰化或去乙酰化，并可导致多种神经系统疾病。因此，很多治疗策略集中在对蛋白质乙酰化状态的调节。新近的研究发现许多HDAC抑制剂可特异性抑制HDAC的作用，并在转录过程中募集HAT，从而引起蛋白质乙酰化，而对多种基因表达水平产生影响，具有多种潜在的临床应用价值［3］。曲古抑菌素A（TSA）是一种链霉素生成物，1990年Yoshida等［10］首先报道了它在体内及体外条件下能够特异性抑制去乙酰化酶的作用，从而引起蛋白质乙酰化。例如，它能够通过抑制HDAC6的作用而上调α-微管蛋白的乙酰化水平，从而弥补Huntington′s病中基于微管的运输缺陷［4］。因此，本研究就选择了TSA作为刺激因素。

NO由一氧化氮合酶（NOS）催化产生，它共有3种亚型，即神经型（NOS1）、诱导型（NOS2）和内皮型（NOS3）。研究发现HAT及HDAC是NOS基因表达的调节因子。例如，HDAC的抑制可增强结合在NOS3近端启动子的H3、H4组蛋白乙酰化水平，从而引起其mRNA表达水平上调［5］。NOS1在神经系统中尤为重要，并与多种神经系统疾病相关［6］。本研究中我们以TSA为乙酰化作用因素，检测乙酰化对神经胶质瘤C6细胞中NOS1基因表达水平的影响。我们的结果显示TSA能够以时间和浓度依赖方式上调NOS1基因mRNA表达水平，这提示了乙酰化参与了NOS1mRNA转录水平的调节。Nuclear run-off实验是一种检测基因mRNA动态变化的方法，它可以排除mRNA半衰期等改变对mRNA水平的影响，因此我们进一步应用该方法检测了NOS1转录效率的变化。结果发现TSA能够上调NOS1转录效率，与mRNA水平的变化一致，证明了TSA引起的NOS1mRNA水平的增加至少部分是由于其转录效率的增加而引起的。

综上，本研究结果证明TSA引起的乙酰化可使神经胶质瘤C6细胞中NOS1基因mRNA表达及NOS1转录效率增加，这有可能为研究某些NO相关的神经系统疾病的发病机制提供分子基础并为其治疗提供新的靶标，而关于TSA上调NOS1表达的确切分子机制仍有待进一步研究。

［1］Dawson TM，Dawson VL，Snyder SH.Anovel neuronal messenger molecule in brain：the free radical，nitric oxide.Ann Neur，1992，32（3）：297-311.

［2］Yoshida M，Kijima M，Akita M，et al.Potent and specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro by trichostatin A.JBiol Chem，1990，265（28）：17174-17179.

［3］Tang YA，Wen WL，Chang JW，et al.ANovel Histone Deacetylase Inhibitor Exhibits Antitumor Activity via Apoptosis Induction，FActin Disruption and Gene Acetylation in Lung Cancer.PLoSOne，2010，5（9）.pii：e12417.

［4］Dompierre JP，Godin JD，Charrin BC，et al.Histone deacetylase 6inhibition compensates for the transport deficit in Huntington′s disease by increasing tubulin acetylation.JNeurosci，2007，27（13）：3571-3583.

［5］Gan Y，Shen YH，Wang J，et al.Role of histone deacetylation in cellspecific expression of endothelial nitric-oxide synthase.JBiol Chem，2005，280（16）：16467-16475.

［6］Chabrier PE，Demerle-Pallardy D，Auguet M.Nitric oxide synthases：targets for therapeutic strategies in neurological diseases.Cell Mol Life Sci，1999，55（8-9）：1029-1035.

（编辑 孙宪民，英文编辑 陈 姜）

Effect of Trichostatin AonNOS1Gene Transcription in Glioma Cells

LIYing-hui，LIChun-yi，CHENFang-jie，ZHAOYan-yan
（Department of Medical Genetics，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effect of acetylation on neuronal nitric oxide synthase（NOS1）gene transcription in rat glioma C6cells by using trichostatin A（TSA）as a treatment of acetylation.MethodsThe expression level ofNOS1mRNAin C6cells treated with different concentrations of TSAwas detected by real-time reverse transcription polymerase chain reaction at different time points.Nuclear run-off assay was performed to assess the changes in NOS1transcription rate in C6cells treated with TSA.ResultsTSAupregulatedNOS1mRNAexpression in a time-and concentration-dependent manner in C6cells.TSAincreased the transcription rate ofNOS1gene markedly.ConclusionTSA-induced acetylation may upregulateNOS1gene transcription in C6cells.

NOS1；trichostatin A；acetylation

R394

A

0258-4646（2010）11-0901-03

辽宁省教育厅高校科研基金资助项目（2008858）；国家自然科学基金资助项目（30900807）

李英慧（1976-），女，副教授，博士.

赵彦艳，E-mail：yyzhao@mail.cmu.edu.cn

2010-09-03