ELISA测定血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C

单桂芬,林 伟,荣墨克,张静春

(1.吉林大学第二医院 检验科,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院)

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cystatin C,Cys C)为非糖基化蛋白质,分子量为13 kDa,等电点约为9.3,由有核细胞产生。其低分子量及高等电点的特性使其容易由肾小球滤过,近曲小管对其重吸收并将其分解。Cys C在体内产生恒定,不受体重、身高、年龄、性别等因素影响。其血液动力学及生理学特点优于血清肌酐对肾功能的判断。当肾小球滤过率下降时血中的Cys C浓度增高,当近曲小管重吸收障碍时尿中的Cys C浓度增高。因此,Cys C是反映肾小滤过率功能及近曲小管重吸收功能的良好内生性指标[1-3]。由于方法学的原因,目前该项检验还没有在临床上广泛应用。本试验用ELISA方法测定血清Cys C,方法简便快速,适于常规检测。

1 材料与方法

1.1 对象 选健康体检者65名。男35名,年龄18-65岁。女30名,年龄20-62岁。采静脉血3 ml,分离血清,放-20℃冰箱,待测。

1.2 试剂和仪器Cys C,辣根过氧化物酶,过碘酸钠,均购自Sigma公司。包被缓冲液:0.2 mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液。稀释液:0.1 mol/L pH 7.4 PBS含1%牛血清白蛋白、0.05%Twen-20、0.4 g/L叠氮钠。洗涤液:0.1 mol/L pH 7.4 PBS。底物:0.1 mol/L pH 5.0柠檬酸 缓冲液,含40%邻苯二胺、0.3%H2O2。终止液:2 mol/L H2SO4。酶标仪(Model 430),聚苯乙稀酶标板。

1.3 抗体制备 0.5 g/L Cys C1 ml与1 ml福氏完全佐剂混合制成乳化液。免疫雌性大耳白兔,分别于4周和6周加强免疫,测定抗体效价达到1∶32以上时,取0.5 g/L CysC 1 ml静注,3天后取血分离血清,以45%饱和度硫酸铵纯化抗体,-70℃保存。

1.4 包被方法 取兔抗Cys C抗体,用包被缓冲液稀释成浓度为5 mg/L,包被聚苯乙稀酶标板,每孔100 μ l,于4℃包被8小时,用洗涤液洗涤3次。以稀释液封闭1小时,然后用洗涤液洗涤3次,吸干。包被后的酶标板用胶纸封好放4℃冰箱保存。

1.5 酶联方法 将10 mg辣根过氧化物酶加5 ml 0.2 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液、5 ml 0.1 mol/L过碘酸钠,混匀后置4℃30 min。加0.1 mol/L聚乙二醇5 ml混匀后置室温30 min。加抗Cys C抗体10 mg,以0.2 mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液透析6 h。加1 ml 5 mmol/L氢硼化钠置4℃2 h。加20 ml 45%饱和硫酸铵置4℃30 min。离心后以稀释液将沉淀溶解,并对其透析6 h,离心去除沉淀。4℃冰箱保存。

1.6 测定方法 包被好的酶标板,放室温30分钟。加100 μ l以稀释液稀释的血清标本,37℃水浴20分钟,洗涤,吸干。加 200 μ l酶标抗体。37℃水浴 20分钟。加200 μ l底物。37℃水浴10分钟。以50 μ l终止液终止反应。用酶标仪测定其吸光度,检测波长为450 nm。根据标准曲线得Cys C浓度。

1.7 标准曲线制作 配制浓度为 0.1、10、50、100、200 μ g/L的Cys C标准物。检测波长为 450 nm。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线。

2 结果

2.1 抗血清鉴定 免疫得40 ml Cys C抗血清,以紫外分光光度法测定蛋白含量为10 mg。琼脂免疫扩散测定抗体效价为1:32。

2.2 最适包被浓度 以0.5-20 mg/L Cys C抗体对浓度为0.1-200 mg/L Cys C作ELISA试验,低浓度Cys C抗体吸光度值低,高浓度Cys C抗体呈非直线,Cys C抗体浓度为5 mg/L时呈良好直线,该浓度的吸光度值为1.025。

2.3 酶标抗体鉴定 以Cys C对酶标抗体作对流免疫电泳,得酶标抗体效价为1:32。以分光光度计对结合物进行定量测定,结合物酶量为0.46 g/L,摩尔比值为1.74,符合酶标抗体的最佳效果。

2.4 最适反应时间 对试验中各反应步骤在不同浓度时不同反应时间的观察,其最适反应时间是:包被浓度为10 mg/L37℃时包被时间为2 h,免疫反应分别为20 min,显色时间为10 min。

2.5 方法学简评 CysC的线性范围为:1-100 μ g/L。回收率为:99.1±3.1%。批内变异为:5.8±0.5%。批间变异为:7.3±0.7%。

2.6 参考值范围 对象组进行参考值测定,每份标本测定3次,以均数加减2个标准差确定参考值范围。分别为:男,1.81±0.73 mg/L。女,1.72±0.69 mg/L。

3 讨论

Cys C检验方法目前主要采用比浊仪及配套试剂以免疫比浊法测定,需要购置相应的设备,使其临床应用受到限制,所得的临床检验实验数据较少,未能广泛应用。ELISA方法是一般临床检验科都能开展的较简便的检验方法,检验设备一般临床检验科都具备,本实验建立以ELISA方法测定血清Cys C,并优选酶联方法和ELISA方法,以求准确快速。免疫过程的静注加强免疫可得到高质量的抗体,要严格遵守此过程。对酶联方法采用加大反应浓度以缩短酶联时间并提高酶联效果。对包被方法加大包被液浓度相应缩短包被时间,以5 mg/L的Cys C浓度包被液,在37℃包被8小时,可达到良好的测定敏感性、精确性和准确性。时间延长未见明显变化。通过试验,测定方法反应时间分别为20分钟,可得良好回收率。显色最适终止时间优选为10分钟。酶标板一次性包被后,冰箱保存可用半年。本方法Cys C的参考值范围为:男,1.81±0.73 mg/L。女,1.72±0.69 mg/L。男女间无显著差别(P＞0.05)。线性范围为:1-100 μ g/L。回收率为:99.1±3.1%。批内变异为:5.8±0.5%。批间变异为:6.3±0.7%。由于本室未开展其它Csy C测定方法,未作方法间的相关性实验。该方法简便快速,准确特异,适于临床常规应用。

[1]俸家富,罗 军,李少林.胱抑素C-肾小球滤过率肌酐替代标记物[J].国外医学(临床生物化学与检验学分册,2005,26(3):168.

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[3]马雪平,郝钦芳,杨晓莉,等.肾脏疾病患者血清Cystatin C测定的临床价值[J].中国卫生检验杂志,2007,17(7):1253.

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[5]管远志,王艾琳,李 坚.医学微生物学实验技术[M].北京,化学工业出版社,2006.194-205.