肿瘤骨转移动物模型研究进展

刘福英

(河北医科大学 河北省实验动物重点实验室，石家庄 050017)

肿瘤骨转移动物模型研究进展

刘福英

(河北医科大学 河北省实验动物重点实验室，石家庄 050017)

骨转移是乳腺癌、前列腺癌及肺癌等肿瘤的常见并发症，是预后不良的独立危险因素。肿瘤骨转移动物模型是研究骨转移发生机制及评价治疗策略的重要工具。现对骨转移动物模型的研究进展进行综述。

肿瘤;骨转移;模型，动物

骨转移是恶性肿瘤的常见并发症，主要见于乳腺癌、肺癌及前列腺癌，发生率在70%左右。骨转移发生后一般会引起溶骨性病变，即造成骨丢失、骨痛、高钙血症、骨折、神经压迫及运动丧失等症状［1］。有关骨转移发生的机制还不确切;另外，骨转移发生后一般是不能治愈的，是导致肿瘤患者死亡的重要原因之一。因此，研制骨转移动物模型对于深入研究肿瘤骨转移发生机制及新的治疗方法有重要意义。建立的骨转移动物模型应具备如下两个特点:(1)与人类肿瘤骨转移过程相似;(2)模型易于建立、具有可重复性，成瘤时间一致，且成瘤后存活时间较长。

由于自发肿瘤的骨转移发生率较低，肿瘤骨转移的转基因动物制备方法还不成熟，因此，肿瘤骨转移模型一般采用肿瘤移植的方法，即将来源于自发性或诱导性动物或人类肿瘤细胞株，通过原位或异位移植，制备动物模型。该模型的优点是成本低、周期短、成瘤时间一致。

1 肿瘤细胞“亲骨”的分子基础

骨特殊的解剖结构和分子特征是肿瘤发生骨转移的重要原因。骨的干骺端拥有丰富的窦状结构，且血流流动缓慢，为肿瘤细胞与内皮细胞间的相互作用及肿瘤细胞在骨髓中集落形成提供了保证［2］。更为重要的是，骨髓中的造血祖细胞及成纤维细胞表达VEGFR-1(血管内皮生长因子-1)、整合素配体及纤维结合蛋白的受体，这些分子的表达为肿瘤细胞的迁徙提供了合适的环境［3，4］。此外，各种生长因子、细胞因子如内皮素、TGF-β、IL-1、IL-6及IL-8通过旁分泌的方式调节肿瘤细胞的生长。表达于骨髓间质细胞的受体如尿激酶受体(uAPR)、血管细胞粘附分子(VCAM-1)、纤维结合蛋白等通过与肿瘤细胞高表达的相应配体结合，促进了骨髓中肿瘤细胞集落的形成［5，6］。细胞外基质蛋白，特别是I型和IV型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液蛋白、骨结合素等，作为肿瘤细胞的趋化因子，对肿瘤细胞集落的形成起着重要作用［7，8］。

骨基质是多种潜在生长因子的储存库，如胰岛素样生长因子、TGF-β、血小板衍生生长因子及血管内皮生长因子等，这些因子在骨的再建过程中释放，可促进最初肿瘤细胞克隆增殖;如果在溶骨及成骨细胞损伤过程中释放这些因子，可刺激肿瘤细胞恶性生长并引起骨的损伤。

根据X光透视结果，骨转移造成的骨损伤分为溶骨型和成骨细胞型，骨转移表型与肿瘤细胞与骨髓微环境中的破骨细胞和成骨细胞的相互作用有关。细胞因子类型可决定骨损伤的类型。如人前列腺癌因高表达与溶骨损伤有关的细胞因子IL-1、RANKL、TNF-α，这些细胞因子参与破骨细胞的分化和激活。另外，人前列腺癌细胞分泌骨保护素、TGF-β，则会形成成骨细胞损伤［9］。

2 肿瘤移植骨转移动物模型

肿瘤移植骨转移动物模型即用已建立的人/鼠肿瘤细胞株种植于免疫缺陷动物体内(裸鼠或SCID小鼠等)所建立的动物模型。按照种植的途径不同可分为:通过血流播散制作的骨转移模型;局部注射制备的骨转移模型;肿瘤原位种植骨转移模型。

2.1 通过血流播散制作的肿瘤骨转移模型

2.1.1 骨靶向性亚克隆肿瘤细胞株的筛选:不论是人源性还是动物源性肿瘤细胞株，虽然可以筛选出有较高骨转移倾向的细胞株用于建立模型，但在实际应用中，尤其通过全身或原位接种时，不一定能全部发生骨转移。如乳腺癌MDA-MB-231及MDAMB-435细胞株能使30%～90%的动物形成骨转移模型，但该模型还可同时伴有脑、卵巢和肾上腺的转移;还有前列腺癌细胞株 RM1，除了有骨转移倾向外，还可向不同软组织转移。骨靶向性亚克隆技术较好地解决了这一问题。其理论基础为，骨转移处的肿瘤细胞与原发灶处的肿瘤细胞在表型和多个免疫指标的检测中都有所不同，可能是肿瘤细胞为不断调整和适应骨微环境而出现表型变化，或者原发肿瘤中包含有骨特异性转移的亚群。而亚克隆技术通过人为给予骨微环境的刺激，在此压力下诱导或筛选出骨靶向性亚克隆细胞株。亲代细胞株和亚克隆细胞株有一定区别，总趋势显示移植瘤在逐渐恶化，骨转移能力在逐渐增强。以目前研究较多的MDA-MB-231骨亚克隆(MDA-231-B)为例，将亲代的 MDA-MB-231细胞注入裸鼠左心室后，引起骨转移的组织于体外扩增筛选，再注入裸鼠左心室，如此反复几个循环后，即可获得骨高转移能力的肿瘤细胞株。

另外，常用的动物源性乳腺癌细胞株是来源于BALB/c小鼠的乳腺癌细胞株4T1、TM40D。将该细胞株经体内反复传代并进行亚克隆化，得到稳定的可移植的骨转移细胞株。使用动物源性乳腺癌细胞移植模型的优点是接种动物免疫功能正常，符合临床情况，费用较裸鼠或SCID动物模型低，且解决了细胞移植所带来的免疫排斥反应问题，尤其可用于研究肿瘤转移过程中的免疫相关机制和免疫细胞的过继治疗等，缺点是种系要求严格，必须是同系或同种受体动物。

2.1.2 静脉注射法:静脉注射法与临床上骨转移产生机制不符，以前很少使用。但最近 Teres等［10］报道，将MDA-MB-231细胞株在裸鼠体内连续多次传代后，筛选出多株不同细胞克隆，给这些细胞克隆转染荧光素酶报告基因，通过活体成像技术发现，B02克隆株与其它细胞克隆不同，该细胞株具有快速形成溶骨型骨转移的能力。实验发现将B02通过小鼠尾静脉注射后，10 d即可形成明显的骨转移。与其它MDA-MB-231平行的细胞系相比，研究组成员发现B02细胞株表达促进骨转移的基因表达标签，即骨转移能力强的B02细胞株与MDA-MB-231相比，有14个基因表达上调，而有44个基因表达下调。另外，Otsuka等［11］报道，将肺癌细胞株ACC-LC-319/bone2静脉注射到SICD小鼠，经 X光检查发现，溶骨性病变出现在28 d，成骨性病变出现在35 d。

2.1.3 心脏注射法:左心室注射法产生的骨转移模型与肿瘤患者骨转移灶无论在生长状况还是形态学上都非常相似，是目前最常用的方法之一。该模型不仅有许多优点，还符合Paget提出的“种子与土壤学说”:肿瘤细胞充当“种子”，骨髓腔微环境充当“土壤”。支持该学说的证据有:肿瘤细胞经左心室注射后，一些细胞在骨微环境中选择性生长进而形成骨转移瘤;抑制溶骨反应可以抑制转移肿瘤的生长。利用该方法制备的模型的缺点是引起脑、肺、肾上腺皮质等的多发性转移，还可造成某些实验鼠骨转移尚未出现而因其它的转移灶致死。

最近 Power等［12］报道了用正常有免疫功能的小鼠，采用心脏注射方法成功制备了前列腺癌骨转移模型。研究者首先将前列腺癌细胞株RM1注射到小鼠心脏，然后从该小鼠的骨组织中分离肿瘤细胞，再将该细胞株注射到小鼠心脏，继续从骨中分离肿瘤细胞，如此反复三次，得到一株骨转移率高、且在软组织转移率低的肿瘤细胞株 RM1(BM)。95%的C57BL/6小鼠在肿瘤注射后3周左右出现骨转移。组织学及 X线断层术检查发现，RM1(BM)肿瘤细胞株形成的骨转移属于溶骨型，但有明显的成骨细胞的改变。另外，体外试验进一步发现RM1(BM)肿瘤细胞高表达E-cadherin(上皮细胞钙粘蛋白)，但不表达弹性蛋白(vimentin)。

2.1.4 局部血管注射制备的骨转移模型:近年来，有学者提出建立特定部位骨转移的动物模型。Neudert等［13］报道在裸大鼠一侧下肢动脉结扎后将MDA-MB-231细胞灌注入股动脉，形成下肢溶骨性病灶，但有50%的病灶在注射42 d后出现自发性缓解。Bauerle等［13］改进方法，利用裸大鼠股动脉分支及其血供分布特点，将MDA-MB-231细胞注入一侧下肢股动脉与髂动脉的交通支即腹壁浅动脉，阻断股动脉血流后通过腹壁浅动脉改变血流方向，使肿瘤细胞进入营养膝关节和小腿血供的膝降动脉和腘动脉。93%动物接种3～4周出现明显的骨转移。

2.2 局部骨内注射制作骨转移模型

该法将针尖直接刺透骨皮质，将移植肿瘤细胞注入胫骨或股骨的骨干。具有致瘤率高、制作方法简单、不受脏器转移影响等优点。缺点是造成了骨皮质和骨髓腔的损伤，且所制作的模型主要为骨干转移，与临床上常见的骨骺端转移不同。骨内注射方法常被用来制作成骨性或成骨/溶骨混合性骨转移模型［14］。常见于前列腺癌骨转移模型，如给免疫缺陷小鼠的胫骨内注入人前列腺癌细胞系CWR22成功地制作出前列腺癌骨转移模型［15］，与临床前列腺癌骨转移进展比较类似，为研究骨转移发生机制和药物疗效提供了一个极具价值的模型工具。还有人采用经股骨内直接注射法，在裸鼠前列腺癌LNCaP骨转移率为0%(0/8)，而在SCID小鼠中其骨转移率为75%(6/8)。因此免疫缺陷鼠比裸鼠更容易产生骨转移灶。

2.3 肿瘤原位移植模型

原位移植是指将乳腺癌或前列腺癌细胞或组织块种植于裸鼠胸壁的乳腺脂肪垫内或前列腺组织从而发生骨转移。用该方法形成的骨转移模型保留了从肿瘤原发灶到骨转移的完整过程，是研究乳腺癌骨转移发生机制的最佳方法。理论上小鼠乳腺癌细胞系所形成的原位接种骨转移模型与临床状况极为相似，因这种模型可在非免疫缺陷鼠体内复制，且骨转移均为自发形成，唯一的区别在于采用小鼠乳腺癌细胞系。该模型对于研究乳腺癌发生机制及治疗对策的评价均有重要价值。但该复制方法也存在缺点，即与上述介绍的血流播散、骨内注射等方法相比，骨转移的发生率偏低，且伴有其他脏器的转移。

相对于乳腺癌原位骨转移模型，前列腺癌原位骨转移模型则较成功。Zhau等［16］报道，将人前列腺癌细胞种植于小鼠前列腺原位，在体内成功地形成了前列腺进展的不同阶段模型:前列腺癌雄激素依赖性生长，雄激素非依赖(但敏感)生长，雄激素非敏感生长，雄激素阻碍生长阶段，最终形成肿瘤转移，其中包括骨转移。前列腺原位注射肿瘤细胞悬液，骨转移发生率较低，而瘤块前列腺原位(SOI)种植则更易于形成骨转移灶。因此，一般先将前列腺癌细胞给小鼠皮下注射，待肿瘤块形成后，将瘤块切下并切割成1mm3的小块，包埋于前列腺包膜下而形成原位肿瘤和骨转移瘤。该方法制备的骨转移模型是一种比较完善的前列腺癌骨转移模型，它保留了从肿瘤原发灶到骨转移的完整过程，为研究前列腺骨转移提供了可靠的实验手段。

2.4 其他类型肿瘤骨转移模

将人骨移植给NOD/SCID小鼠，人骨在小鼠体内可存活20周以上。这种携带人骨的NOD/SCID小鼠，为人源细胞株提供了生存环境［17］。已观察到有几种乳腺癌细胞株可在人骨-NOD/SICD系统内生长，但不同细胞株的行为不完全一样。人们用稳定转染绿色荧光蛋白(GFP)的乳腺癌细胞株GFPMDA-MB-231观察到，该细胞株可特异性地转移到植入的骨在组织。

最近利用人骨-SICD系统制备骨转移模型的方法有了新的进展［18］。具体方法是，给 SICD小鼠在背部皮下移植人骨，然后将1×106人乳腺癌干细胞样细胞的一个亚克隆细胞株(表型为 CD44+/CD24lower)和1×106人乳腺癌 MDA-MB-231细胞株分别通过尾静脉注射。CD44+/CD24lower表型代表了一个小的乳腺癌亚型，该亚型具有很强的自我更新的潜能，且表现出高的亲骨能力。该方法制备的荷瘤小鼠的骨转移率高达77.8%，且没有发现伴有其他部位的转移。进一步研究发现，将女性股骨头内有活性的松骨质植入T、B及NK缺陷的SICD小鼠，4周内移植的人骨可建立起人骨血液循环，骨活性保持8周以上，成为人源性骨转移的“土壤”。因此，“人源性”乳腺癌转移小鼠模型的人骨转移发生率优于“非人源性”乳腺癌转移小鼠模型。人源性乳腺癌细胞亲人骨转移的机制，应与人骨中的人源性成骨细胞、破骨细胞、骨基质细胞等分泌的骨趋化因子诱导人乳腺癌细胞定向转移到人骨有关。

3 小结

肿瘤骨转移动物模型依然是研究肿瘤骨转移的分子机制、骨转移防治及病理不可或缺的必要工具。很显然，骨髓微环境中不同细胞(包括内皮细胞、间质细胞、造血细胞及骨细胞)之间的相互作用，对于肿瘤细胞在骨中定位和克隆形成具有重要作用。骨转移是一非常复杂的过程，涉及许多基因参与，因此，后续的工作应利用现有的骨转移动物模型，通过基因组学和蛋白组学的方法对涉及肿瘤骨转移的基因进行鉴定，以发现可用于骨转移早期诊断及防治的靶子。

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The Research Progress for Animal Models of Bone Metastasis

LIU Fu-ying
(Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

Bone metastasis is not only a common complication for breast cancer，prostatic carcinoma as well as lung cancer，but also a independent risk factor of prognosis mala for tumor patients.Animal models of bone metastasis are important tools for researching the bone metastasis mechanisms and evaluating the therapy strategies.A summary was done for the progress of animal models of bone metastasis.

Tumor;Bone metastasis;Model，animal

R73

A

1671-7856(2010)07-0001-04

2010-01-25

刘福英，男，教授，主要研究方向:实验动物管理及人类疾病动物模型。E-mail:lfy5579@126.com