液态发酵法制备菜籽ACE 抑制肽培养基条件优化

王立峰，金 晶，袁 建，何 荣，鞠兴荣

液态发酵法制备菜籽ACE 抑制肽培养基条件优化

王立峰1,2，金 晶1，袁 建1，何 荣1,2，鞠兴荣1

(1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

以菜籽粕为原料，通过枯草芽孢杆菌液态发酵生产菜籽ACE抑制肽。先以肽得率、ACE抑制率为指标通过单因素试验得到液态发酵的培养基条件，再以响应面分析法，优化枯草芽孢杆菌液态发酵培养基中的3种成分，确定枯草芽孢杆菌发酵生产菜籽肽的最佳培养基工艺条件为：磷酸二氢钾0.45g/100mL、葡萄糖0.8g/100mL、料液比1:23、初始pH7.0。优化后的ACE抑制率可达69.79%。

菜籽肽；液态发酵；ACE抑制肽；响应面分析法

菜籽粕是菜籽榨油之后的副产品，其蛋白质含量为35%～42%[1]，菜籽蛋白的氨基酸组成符合FAO/WHO推荐模式值，是一种优质的蛋白质[2]。但是在菜籽蛋白中含有硫苷及其分解产物、酚类化合物和植酸等有害物质，使其应用受到了一定的限制。近年来，随着双低油菜的培育成功[3]和对菜籽粕脱毒技术[4]的发展，菜籽蛋白的利用得到了很大的提升，为菜籽蛋白产品的进一步开发利用打下了坚实的基础。

菜籽蛋白经水解产生的小肽具有多种生物活性[5-6]，其中ACE抑制肽由于安全性高、副作用少、易吸收，已经成为了活性肽研究的热点[7-8]。发酵法制备大豆[9-11]和牛奶[12-13]ACE抑制肽的研究在我国已有报道，而使用液态发酵制备菜籽ACE抑制肽的研究目前在国内尚未见报道，因此具有很高的研究价值。

为了进一步提高菜籽ACE抑制肽的抑制率，本研究以枯草芽孢杆菌为实验菌株，应用单因素和响应面分析法对菜籽粕液态发酵的培养基条件进行优化，以ACE抑制率为响应值，采用多元二次回归拟合方程，优化液态发酵培养基的配比。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Bacillus.subtilis 10160产蛋白酶菌种 中国工业微生物菌种保藏中心；菜籽粕(以Canola 菜籽为原料，通过索氏抽提脱油制得，粗蛋白含量43.26%)。

牛血清白蛋白、细胞色素、钴胺酰胺(VB12)、Gly-Gly-Tyr-Arg、血管紧张素转化酶(ACE)(0.25U)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma 公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；超净工作台 苏净集团安泰公司；PHS-3C型精密数显pH计、722N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器厂；GL-20B型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；全温立式振荡培养箱 太仓市实验设备厂；HH-4数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基础培养基

将保藏的枯草芽孢菌种接入基础培养基(牛肉膏0.3g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL，琼脂2.5g/100mL)，在30℃条件下培养24h，使其转接活化。

1.3.2 种子培养基

挑取2环枯草芽孢杆菌种子培养基(牛肉膏0.3g/100mL，蛋白胨1g/100mL，氯化钠0.5g/100mL)活化后菌株，接入锥形瓶，8层纱布封口，在恒温振荡培养箱中进行扩大培养，控制温度30℃，转速180r/min，培养24h。使其菌体浓度达到108个/mL。

1.3.3 发酵培养基

从已制备好的种子培养基中取出一定体积的菌悬液接入已灭菌液态发酵培养基(含有菜籽粕、磷酸二氢钾和葡萄糖)中进行液态发酵，发酵锥形瓶用8层纱布封口，在30℃，180r/min的恒温振荡培养箱内进行培养，培养一定时间后取样测定。

1.3.4 发酵液处理

将培养一定时间的发酵产物取出，2～4℃条件下4000×g离心15min，测定其上清液体积，用0.45μm微孔滤膜过滤上清液，除去不溶物和细菌，备用。

1.3.5 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定

从活化后的枯草芽孢杆菌斜面上挑取2环，接入液体种子培养基中，控制培养温度30℃，转速180r/min，每隔2h取一次样(5mL)，4000×g离心15min沉淀菌体，去除上清液后，菌体沉淀以无菌蒸馏水悬浮，混匀定容至10mL，于波长600nm处测定其吸光度。

1.3.6 细菌数量测定

血球板计数法测定[14]。

1.3.7 多肽得率测定

参照文献[15]所述方法，取2.5mL处理液，加入等体积10%的三氯乙酸(TCA)，静置30min，2～4℃条件下5000×g离心20min，取2mL上清液，加8mL双缩脲试剂，25℃静置30min，测OD540nm值，通过肽含量标准曲线得到其肽含量，肽得率按公式(1)计算。

1.3.8 ACE抑制活性的测定

ACE抑制活性的测定参照Cushman等[16]的方法，做适当修改，具体步骤如下：用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)将HHL配制成5.0mmol/L的溶液。取100μL的HHL和40μL的水解产物混合，于37℃保温3min后，加入10μL ACE(溶于蒸馏水，比活力为0.1U/mL)，混匀后37℃保温30min，加入250μL 1mol/L的HCl溶液以终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，15s振荡混匀，5000×g离心10min，用移液管吸取1mol/L醋酸乙酯层，真空冷冻干燥2h后，加入3mL蒸馏水，在波长228nm处测定其吸光度。ACE抑制活性按公式(2)计算。

式中：A1为ACE及ACE抑制肽均参与反应时所测吸光度；A2为ACE抑制肽不参与反应时所测吸光度；A0为ACE不参与反应时所测吸光度。

1.4 数据处理

数据均采用平均值±标准差表示；用t检验进行显著性检验。

2 结果与分析

2.1 枯草芽孢杆菌生长曲线

图1 枯草芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve ofBacillus subtilis

枯草芽孢杆菌生长繁殖比较快，在适宜条件下，20～30min就可以分裂一次，从图1可以看到，在发酵的开始阶段，菌体数量增加并不多(0～10h)，一定时间

后，菌体数量增长很快(12～28h)，随后菌体增长进入稳定期(28～34h)，在34h后，随着菌体数量增大，培养基内营养物质的消耗和自身代谢产物的大量产生，菌体进入衰亡期。因此，12～28h是此菌株的生长对数期，由于对数期的微生物细胞生长平衡，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，群体的形态与生理特征最一致，并且抗不良环境的能力强，所以在后续实验中，均以培养24h左右的菌株为种子液。

2.2 肽含量标准曲线

用5% TCA配制不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg标准溶液，按照多肽含量测定方法显色，于波长540nm处测定OD540nm值。以多肽质量浓度为横坐标，OD540nm值为纵坐标，制作标准曲线，得到回归方程：y=0.0257x+ 0.0029，R2=0.9995。

2.3 培养基葡萄糖质量浓度对肽得率和ACE抑制率的影响

图2 葡萄糖质量浓度对菜籽肽得率和ACE抑制率的影响Fig.2 Effect of glucose concentration on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

葡萄糖在碳源中最易被利用，几乎所有的微生物都可以利用葡萄糖，因此，本实验选用葡萄糖作为液态发酵培养基中碳源的主要成分。由图2可以看出，较高质量浓度的葡萄糖有利于液态发酵环境下肽得率和ACE抑制活性的提高。这是由于葡萄糖作为一种速效碳源，可以在菌种发酵初期提供大量碳源维持其生长势头，从而产生大量的蛋白水解酶。但是过高的葡萄糖质量浓度反而会降低多肽产量以及ACE抑制活性，这是由于发酵过程中过多的葡萄糖会加速菌体呼吸，使培养基中溶解氧不能满足菌体的需要。一些酸性中间代谢物如乳酸、丙酮酸、乙酸等不能完全氧化而积累在菌体和培养基中，导致培养基pH值降低，从而抑制细菌的生长和水解酶类的合成。

当葡萄糖质量浓度为0.5g/100mL时，所得菜籽肽的ACE抑制活性最高，而当葡萄糖质量浓度为0.7g/100mL时，菜籽肽得率达到最高。ACE抑制活性没有进一步随着肽得率的提高而增高可能是由于在多肽产生的过程中，多肽自身也在被酶解，转化为了不具有ACE抑制活性的小肽。因此，ACE抑制肽生产的较佳葡萄糖质量浓度为0.5g/100mL。

2.4 培养基KH2PO4质量浓度对肽得率和ACE抑制率的影响

图3 KH2PO4质量浓度对菜籽肽得率和ACE抑制率的影响Fig.3 Effect of KH2PO4concentration on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

KH2PO4作为微生物培养基中常用的无机盐之一，可以提供微生物生长所需的矿物元素，但是，KH2PO4质量浓度过高同时也会抑制菌种的生长和产酶，由图3可以看出，较低质量浓度的KH2PO4可以显著提高菜籽肽得率和ACE抑制率，当KH2PO4质量浓度为0.3g/100mL时，菜籽肽得率和ACE抑制率均达到最高，分别为20.49%和58.12%，因此，发酵较佳的KH2PO4质量浓度为0.3g/100mL。

2.5 培养基料液比对肽得率和ACE抑制率的影响

图4 料液比对菜籽肽得率和ACE抑制率的影响Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

培养基料液比(菜籽粕质量与加水量之比)决定了液态发酵培养基的菜籽粕量以及含水量，菜籽粕作为本实验中唯一的氮源，一方面可以提供微生物生长所需的氮，另一方面菜籽粕中的菜籽蛋白可被水解酶类作用而生成菜籽多肽。而培养基含水量的变化，对微生物的生长及代谢能力产生重要影响。因此，料液比对肽得率和ACE抑制活性都有较大的影响。从图4可以看出，当

培养基料液比在1:15～1:25时，肽得率达到较大值，它们之间的差异不是很大，但是料液比过高或者过低，都不利于ACE抑制肽的产生，因此，选择料液比1:20作为较佳的液态发酵指标。

2.6 培养基pH值对肽得率和ACE抑制率的影响

图5 pH值对菜籽肽得率和ACE抑制率的影响Fig.5 Effect of pH on the yield and ACE inhibitory rate of rapeseed peptide

由图5可知，枯草芽孢杆菌液态发酵产ACE抑制肽的较佳pH值为7.0，在此条件下，肽得率达到最大，同时，ACE抑制活性也达到最高，随着pH值的改变，肽得率和ACE抑制活性较其他因素相比，变化都不是很明显，其中ACE抑制率极差为0.85%，因此，选择pH7.0最为液态发酵的较佳pH值。

2.6 响应面分析法优化发酵条件结果分析

2.6.1 试验因素选择及结果

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，以菜籽肽ACE抑制率为响应值，对液态发酵影响较大的3个因素设计响应曲面试验以确定最优培养基条件。因素编码及各自变量水平见表1。

表1 Box-Behnken中心组合试验设计因素水平及编码Table 1 Factors and levels in Box-Behnken central composite design

为了最优拟合多元二次模型方程各项系数，依据统计学实验设计要求，对影响菜籽肽得率的发酵培养基关键内在因素进行了15组试验，15组试验分为析因点和零点。试验号1～12是析因试验，13～15是中心试验。其中析因点为自变量取值在x1，x2，x3所构成的三维定点，零点区域为中心点，零点试验重复3次，以估计试验误差，结果见表2～4。

表2 Box-Behnken试验设计及菜籽肽得率实测值与预测值Table 2 Box-Behnken central composite design arrangement and actual and predicted values of rapeseed peptide yield

表3 菜籽肽得率二次多项式模型方差分析Table 3 Analysis of variances for rapeseed peptide with various fermentation conditions

表4 菜籽肽得率回归方程系数显著性检验Table 4 Significance of regression coefficients of fitted regression equation for rapeseed peptide yield

利用Designexpert软件对表2实验数据进行多元回归拟合，获得枯草芽孢杆菌液态发酵菜籽粕产ACE抑制肽培养基组成编码自变量的二次多项回归方程为：

Y=67.04+3.03X1+2.98X2+1.96X3+0.60X1X2+0.81X1X3+ 1.37X2X3－2.26X12－4.51X22－4.06X32(3)

方程中X1、X2的系数均较大，表明KH2PO4质量浓度、葡萄糖质量浓度对ACE抑制率最具有显著意义。

一次项和交互项系数均为正值，可以认为一次项和交互项方程主要对ACE抑制率起正作用，而二次项则对其起负作用。

由表3可见，本试验所选用的二次多项模型具有高度的显著性(P=0.0003)，失拟项在α=0.05水平上不显著(P=0.759＞0.05)，其校正决定系数为0.9663，表明此模型拟合优度好，ACE抑制率仅有3.37%的总变异不能由此模型进行解释。

由表4可见，试验各因素对ACE抑制率的线性效应和曲面效应皆显著，表明在发酵培养基中，KH2PO4质量浓度、葡萄糖质量浓度、料液比的组成均对ACE抑制率有显著影响；X2X3交互作用影响也显著，说明在培养基中，葡萄糖质量浓度和料液比之间的交互作用亦能对ACE抑制率造成显著影响。X1X2、X1X3之间的交互影响不显著，P值分别为0.2360和0.1276，均大于0.05，说明在液态发酵中KH2PO4质量浓度和葡萄糖质量浓度，以及KH2PO4质量浓度和料液比之间的交互影响不明显。

2.6.2 ACE抑制率的响应面分析与优化

图6 培养基葡萄糖质量浓度和料液比交互影响ACE抑制率的曲面图及其等高线图Fig.6 Response surface and coutour plots showing the interactive effects of glucose concentration and solid-liquid ratio on the ACE inhibitory rate

如图6所示，葡萄糖质量浓度和料液比对ACE抑制率影响的交互作用显著。当葡萄糖质量浓度在0.7～0.8g/100mL，料液比在1:20～1:22.5时，ACE抑制率高于67%。发酵培养基必须维持一个适当的碳氮比，碳源过多，容易使有机酸积累，导致培养液pH值偏低，从而抑制菌体生长；碳源不足则引起菌体生长缓慢。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，易导致pH值偏高，溶氧不足，不利于水解酶类的积累；氮源不足，影响菌体生长繁殖，易引起菌体衰老、自溶，从而影响产量。这与图6得出的结论相同。

2.6.3 液态发酵生产ACE抑制肽最优条件的确立

为了进一步验证最佳点的值，对回归方程(3)取一阶偏导等于零并整理得：

解得X1=0.8、X2=0.45、X3=0.4。

代入回归方程(3)，解得预测的最高ACE抑制率为69.3%。转换后得到最佳培养基配比为：KH2PO4质量浓度0.46g/100mL、葡萄糖质量浓度0.79g/100mL、料液比1:22.7。为了方便培养基的配制，确定培养基的最优配方为：KH2PO4质量浓度0.45g/100mL、葡萄糖质量浓度0.8g/100mL、料液比1:23。

2.6.3 模型验证实验

根据Box-Behilken实验所得的结果和二次多项回归方程，利用Designexpert软件获得了ACE抑制率最高时的最佳工艺条件。为了验证其优化结果的可靠性，在最佳发酵培养基中进行5组平行实验，所得ACE抑制活性分别68.26%、71.35%、70.14%、69.27%、69.95%，平均值为69.79%，回归方程所得到的ACE抑制活性预测值与验证实验的平均值相接近，说明该模型能够较好地预测ACE抑制活性值。

3 结 论

以ACE抑制率为考察指标，经单因素试验确定KH2PO4质量浓度、葡萄糖质量浓度和料液比对ACE抑制率有显著影响，在此基础上，采用响应面分析法，根据Box-Behnken 中心组合原理设计三因素三水平试验，用Design-Expert 软件处理试验数据，得到ACE抑制率回归模型，并求取模型最优值时各因素水平。结果表明：枯草芽孢杆菌液态发酵菜籽粕产ACE抑制肽培养基的最优配方为：KH2PO4质量浓度0.45g/100mL、葡萄糖质量浓度0.8g/100mL、料液比1:23(m/V)，在该最佳条件下，ACE抑制率理论上可达69.3%。在所得最佳条件下进行模型验证实验，所得ACE抑制率平均值为69.79%，与回归方程所得最佳ACE抑制率相接近。

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Optimization of Liquid-state Fermentation Conditions for Preparing Rapeseed Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides

WANG Li-feng1,2，JIN Jing1，YUAN Jian1，HE Rong1,2，JU Xing-rong1
(1. Jiangsu Province Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Rapeseed meal was used to prepare angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptide through liquidstate fermentation by Bacillus subtilis. The optimal fermentation conditions were explored by single factor and response surface experiments through evaluating the yield of peptide and ACE inhibitory rate. The optimal fermentation conditions were 0.45 g/100mL potassium dihydrogen phosphate, 0.8 g/100mL glucose, material/liquid ratio of 1: 23 and initial pH 7.0. The ACE inhibitory rate reached up to 69.79% under these optimal fermentation conditions.

rapeseed peptide；liquid-state fermentation；ACE inhibitory peptide；response surface methodology

TQ936.16

A

1002-6630(2010)21-0226-06

2010-01-10

江苏省自然科学基金项目(BK2010573)；江苏省农业科技自主创新资金项目(cx(10)444)；

国家农业成果转化基金项目(2009C10045)

王立峰(1977—)，男，讲师，博士研究生，研究方向为食品营养及功能性成分。E-mail：wanglifeng_8@163.com