脐带间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调及多系统萎缩小脑型临床分析

刘 静 薛 梅 朱 玲 丁丽阎 洪 敏 王志东 韩冬梅 郭子宽 王恒湘

脐带间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调及多系统萎缩小脑型临床分析

刘 静 薛 梅 朱 玲 丁丽阎 洪 敏 王志东 韩冬梅 郭子宽 王恒湘

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSC）鞘内注射，治疗脊髓小脑性共济失调（SCA）及多系统萎缩小脑型（MSA-C）的临床效果。方法2009年10月至2010年9月，对14例SCA及10例MSA-C患者，给予UC-MSC鞘内注射治疗，每次1×106cells/kg，1次/周，4次为1个疗程。其中3例SCA患者接受2个疗程，余均接受1个疗程。采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表（ICARS）及日常生活量表（ADL）对患者治疗前后神经功能进行评定，分值越高表示神经功能缺损越严重。结果本组患者治疗后1个月与治疗前比较，ICARS及ADL明显降低（P＜0.01）。除1例SCA患者治疗无效外，其余患者均有效，表现为行走和站立不稳、运动迟缓、上肢精细动作障碍、书写困难、构音障碍等临床症状得到改善。治疗后常见不良反应有头晕（4例）、腰痛（2例）、头痛（1例），但均在1～3 d内自行消失。结论UCMSC鞘内注射治疗是安全的，可以一定程度地改善SCA及MSA-C患者的临床症状，提高患者生活质量。

脐带间充质干细胞脊髓小脑性共济失调多系统萎缩

脊髓小脑性共济失调（SCA）及多系统萎缩小脑型（MSA-C）均以小脑共济运动障碍为主要临床表现的中枢神经系统变性疾病，最常累及的部位为小脑，还可累及橄榄核、脑桥、脊髓等部位，表现为行走和站立不稳、上肢精细动作差、构音障碍、意向震颤等。该类患者的病情呈进行性进展，最后丧失自主生活能力，给家庭和社会造成极大负担。药物治疗效果欠佳。脐带间充质干细胞（UC-MSC）来源于脐带，易于获取，可在体外大量扩增，具有低免疫原性。此外，MSC可以分泌大量的生物活性物质，能促进神经组织的修复。我们采用UC-MSC鞘内注射治疗14例SCA和10例MSA-C患者，取得一定疗效。

1 材料与方法

1.1 对象

1.2 方法

1.2.1 UC-MSC制备

[1]的方法，经知情同意及感染源检定后收集脐带，去除外膜和动、静脉，将脐带剪成0.5 cm3大小的组织块，加入等体积0.2%Ⅰ型胶原酶，37℃消化过夜。次日，加入两倍体积的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min离心10 min收集细胞，计活细胞数。将细胞悬浮于人MSC无血清培养基中，按1×106cells/cm2底面积接种于塑料培养瓶中。1周后出现由数十个形态类似于成纤维细胞组成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，按6 000 cells/cm2底面积进行传代培养。利用流式细胞技术测定细胞表型，常规感染源检定后，收集细胞用于治疗。或收获细胞放于-80℃冰箱冻存备用，用前在37℃环境下快速复苏后再培养24～48 h，收获贴壁生长的细胞供临床应用。

1.2.2 UC-MSC注射

入院第3、4天，对患者按诊疗常规进行腰穿，鞘内注射UC-MSC，每次10 mL（1×106cells/kg），1次/周，4次为1个疗程。注射时，将UC-MSC+地塞米松5 mg在10 min内缓慢注入蛛网膜下腔，拔针，敷以无菌辅料，嘱患者去枕平卧6 h。治疗周期内对患者进行系统康复锻炼。

1.2.3 评估标准

采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表（ICARS）[2]及日常生活量表（ADL）[3]对患者治疗前及治疗后1个月的神经功能及生活质量进行评定，分值越高表示神经功能缺损越严重。

1.2.4 不良反应及并发症观察

观察治疗中及治疗后有无发热、腰痛、头痛、头晕等不良反应。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS 11.5软件包进行统计处理，以x±s表示，行数据配对t检验分析，P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果

2.1 临床疗效

本组24例患者，除1例无效外，余均获得一定程度改善；3例SCA患者第一疗程有效后，于3个月后接受第二疗程治疗，获得进一步改善。针对有效的23例患者所进行的26个疗程进行ICARS评分：姿势和步态障碍改善25例次（1例无变化）；动态功能（共济运动、描图）改善22例次（1例无变化，3例正常，其中2例为经第一疗程后转为正常）；语言障碍改善8例次（12例次无变化，4例次正常）；眼球运动障碍仅1例患者两疗程均有改善（6例次无变化，18例次正常）。针对有效的23例患者所进行的26个疗程进行ADL评分：19例次日常生活自理能力改善，7例次无变化。

本组患者共进行了27个疗程的治疗，治疗前后的ICARS及ADL评分均有显著差异（表1），治疗前后ICARS中各单项评分中除眼球运动障碍无显著差异外，余均有显著改善（表2）。

表1 患者治疗前后ICARS及ADL评分变化

表2 患者治疗前后ICARS中各单项评分变化

SCA患者治疗前后ICARS、ADL评分均有显著差异（P＜0.01，P＜0.01），MSA患者治疗前后ICARS、ADL评分均有显著差异（P＜0.01，P＜0.05）（图1）。

图1 SCA患者及MSA患者治疗前后ICARS、ADL评分变化

2.2 不良反应及并发症

目前，已有学者使用基于词向量与深度学习的语义相似度计算模型在英文答案选择系统进行了相关研究[14-15]，并取得了不错的效果，但并未将其泛化到语义相似度计算问题中。相对于英文有天然的空格间隔，中文文本语义相似度计算需要设计复杂的中文分词算法，且中英文之间的语义、语法的差距较大，英文的语义相似度计算方法不能直接应用到中文文本中。在目前的文献中，很少有使用词向量与深度学习结合对中文文本进行语义相似度计算的研究。

UC-MSC治疗中及治疗后，患者的生命体征均平稳。2例腰穿后去枕平卧时感头晕，起来后症状逐渐消失，后经相关检查表明与其患颈椎病有关。2例治疗后感腰痛，2例头痛，未经特殊处理，1～3 d后症状消失。无发热及其他不良反应。

3 讨论

SCA与MSA-C均以小脑性共济失调为主要表现，根据发病年龄（前者为30余岁，后者为50～60岁）、遗传模式（前者多为常染色体显性遗传，后者多为散发）、基因检测、MRI检查可加以区分。由于基因缺陷、代谢异常等因素导致小脑、橄榄核、脑桥、脊髓等部位神经细胞变性，药物治疗不能逆转疾病进展，预后差，细胞治疗成为其研究热点。间充质干细胞（MSC）具有多向分化潜能，尤其能向神经细胞方向分化，在修复中枢神经系统损伤和疾病方面具有潜在作用。

动物实验已证明，MSC具有促进神经修复的作用。将大鼠MSC注入脊髓损伤大鼠蛛网膜下腔，损伤部位的MSC明显高于未受损部位，一些MSC可分化为神经元或神经胶质细胞，促进脊髓损伤的修复，且在体内无免疫排斥[4]。将未经任何诱导的人UC-MSC移植至帕金森模型大鼠和正常大鼠，无排斥反应，无肿瘤产生及其他不良反应。治疗后的第6周开始，尤其至第12周，帕金森模型大鼠临床症状得到明显改善，但同时检测移植的人UC-MSC在大鼠大脑中未能成活。作用机理可能与人UC-MSC分泌多种多巴胺神经元营养因子及存活因子和成纤维细胞生长因子有关，亦或与人UC-MSC具有的免疫抑制作用有关，使得受损的神经元恢复功能[5]。移植人UC-MSC可有效改善卒中模型大鼠的神经功能。人UC-MSC有向大脑缺血区迁移的能力，在损伤区域向胶质细胞、神经细胞、血管内皮细胞分化，促进损伤部位神经及血管形成，进而改善缺血区的血流。人UC-MSC分泌的各种神经营养因子在神经损伤修复中起到重要作用[6－7]。在临床试验中，Lee等[8]将自体骨髓MSC通过静脉或动脉输注，治疗11例多系统萎缩患者，经过12个月的研究观察，与对照组相比，症状得到明显改善，两组间UMSARA评分有显著差异。而将UC-MSC蛛网膜下腔注射治疗SCA与MSA-C国内外未见报道，我们用上述方法治疗24例此类患者，23例有效，其中3例接受第二疗程治疗后获得了进一步改善，ICARS及ADL评分治疗后明显下降。有效患者多表现为行走、站立不稳、运动迟缓、上肢精细动作障碍、书写困难、构音障碍等临床症状得到改善。无免疫反应及其他严重不良反应发生。

MSC可来源于骨髓、脐带以及脐血。骨髓MSC含量低，104～105个骨髓单个核细胞含有1个MSC，患者要经历采髓过程，还需要等待3周左右体外培养扩增；人脐血含有MSC，但传代培养困难，不易大量获得；人脐带华尔通胶含有丰富的MSC，在体外能够大量扩增，还可将其冻存，应用前复苏，短时间内即可收获足量的细胞用于临床治疗。Shetty等[9]比较骨髓、脐带、脐血获得的MSC，这三种来源的MSC具有同样的MSC表面分子表达：CD73+、CD105+、SSEA4+、CD29+、CD44+、HLA ABC+，而UC-MSC与脐血间充质干细胞（UCB-MSC）不表达与移植排斥相关的HLA DR，在体外长期培养过程中能保持其多向分化潜能，在特定条件下能分化为神经细胞，表达神经细胞的相关标记和基因。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制，并抑制T细胞增殖，异体移植该细胞可产生免疫耐受性[10]，表明其为一类免疫缺陷细胞，异基因移植不会发生免疫排斥反应。基于上述研究成果，我们采用了脐带来源的MSC用于治疗。

迄今为止，MSC治疗SCA、MSA-C等神经变性性疾病的机制尚不完全清楚，可能与MCSs所介导的神经保护作用有关，包括：①细胞替代，用可替代的功能细胞替代变性的神经细胞；②产生多种神经营养因子（NIFs）支持神经细胞生存，诱导内源性神经细胞再生，促进神经纤维在损伤部位再生，包括脑源性生长因子（BDNF）、β神经生长因子（β-NDF）、胶原细胞生长因子（GDNF）等；③由于神经炎性机制在神经变性性疾病发病机制中起着重要的作用，因此通过免疫调控机制抑制慢性炎性反应，达到治疗作用[11－12]。在临床应用方面，可通过鞘内注射、静脉输注、动脉输注的途径治疗患者[12]。

我们的临床应用研究结果表明，UC-MSC蛛网膜下腔注射治疗SCA、MSA-C是安全的，可在一定程度上改善神经功能。但上述疾病属进展性神经变性疾病，我们的治疗方法系非病因治疗，无法根治疾病，只能在一定时间内改善症状、延缓疾病进展。至于间隔多久再重复下一疗程的治疗而能使疗效继续得以保持，最佳的鞘注MSC的数量，最好的治疗途径等等问题，需要大量病例的长期的随机对照研究，我们将在今后的工作中继续对此进行研究。

参考文献

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[2]黄红云.中枢神经修复学[M].北京:北京科学出版社,2009,479-482.

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[8]Lee PH,Kim JW,Bang OY,et al.Autologous mesenchymal stem cell therapy delays the progression of neurological deficits in patients with multiple system atrophy[J].Clin Pharmamacol Ther, 2008,83(5):723-30.

[9]Shetty P,Cooper K,Viswanarhan C.Comparison of proliferative and multilineage differentiation potentials of cord matrix,cord blood,and bone marrow mesenchymal stem cells[J].Asian J Transfus Sci,2010,4(1):14-24.

[10]Cho PS,Messina DJ,Hirsh EL,et al.Immunogenicity of umbilical cord tissue derived cells[J].Blood,2008,111(1):430-438.

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[12]Lee PH,Park HJ.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell therapy as a candidate desease-modifying strategy in Parkinson's disease and multiple system atrophy[J].J Clin Neurol,2009,5(1): 1-10.

Clinical Analysis on the Treatment of Spinocerebellar Ataxia and Multiple System Atrophy-Cerebellar Type with Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells

LIU Jing1,XUE Mei1,ZHU Ling1,DING Li1,YAN Hongmin1,WANG Zhidong1, HAN Dongmei1,GUO Zikuan2,WANG Hengxiang1.
1 Department of Hematology,General Hospital of the Air Force,Beijing 100142,China;2 Department of Experimental Hematology,Beijing Institute of Radiation Medicine,Beijing 100850,China. Corresponding author:WANG Hengxiang.

ObjectiveTo observe the clinical effect of umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSC)in the treatment of spinocerebellar ataxia(SCA)and multiple system atrophy-cerebellar type（MSA-C）by intrathecal injection.Methods From Oct 2009 to Sep 2010,14 cases with SCA and 10 cases of MSA-C were given UC-MSC by weekly intrathecal injection at a dose of 1×106cells/kg for four times as a course.All the patients received 1 course of treatment except 3 cases received 2 cycles.The movement ability and the quality of daily life were evaluated with the International Cooperative Ataxia Rating Scale(ICARS)and Activity of Daily Living Scale(ADL)and the scores were compared with those before the treatment. ResultsThe results showed that the scores were significantly decreased 1 month after treatment(P＜0.01).The symptoms, including unstable walking and standing,slow movement,upper limb fine motor disorders,writing difficulties and dysarthria, were greatly improved except one patient who had no response.The observed side effects included dizziness(4 patients), back pains(2 cases)and headache(1 case),which disappeared within 1-3 days.ConclusionUC-MSC implantation is safe, and able to ameliorate clinical symptoms and improve life quality of SCA and MSA-C patients to some extent as well.

Umbilical cord mesenchymal stem cells;Spinocerebellar ataxia;Multiple system atrophy

R742.8+2

A

1673－0364（2010）05－0257－04

2010年9月3日，

2010年9月29日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.05.005

首都发展基金重点项目（2007-2033），国家高技术研究发展计划（863项目）（2007AA02Z454），国家重大新药创制基金（2009ZX09503-019）。

100036北京市空军总医院血液科（刘静，薛梅，朱玲，丁丽，阎洪敏，王志东，韩冬梅，王恒湘）；100850北京市北京放射与辐射医学研究所（郭子宽）。

王恒湘。