染料木黄酮脂质体的制备及其对肿瘤细胞体外增殖的抑制作用

杨春宝,丁江华,郑章清

染料木黄酮(genistein),又名 5,7,4-三羟基异黄酮,可通过多种机制发挥抗肿瘤作用。脂质体作为一种新型药物载体,可有效降低毒副作用,且免疫脂质体可将药物靶向释放到靶分子。本研究制备了染料木黄酮脂质体(GL),并以肺腺癌细胞株 A549细胞、肝癌细胞株 HepG2为实验对象,考察 GL对肿瘤细胞体外增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters 600型高效液相色谱系统;DiamonsilTMC18ODS分析柱;BIO-RAD 680型酶标仪;RE-52旋转蒸发仪;LA-950型激光粒度分析仪;VORTEX21K高速冷冻离心机。染料木黄酮标准品;MEM培养基;胎牛血清(FBS);非必需氨基酸;胰蛋白酶;乙二胺四乙酸;胆固醇;大豆卵磷脂;甲醇;四甲基偶氮唑蓝;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养 A549肺腺癌细胞株和 HepG2肝癌细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所(ATCC number分别为 CCL-185和 HB-8065TM)。分别常规培养于含 10%FBS的 RPMI-1640培养基和改良MEM培养基中。培养条件：5%CO2、湿度 95%、37℃。每周传代 2次。待细胞基本长满后,弃去旧培养基,以适量 2.5 g/L胰蛋白酶和 0.2 g/L乙二胺四乙酸(体积比为 1∶1)混合液将细胞消化约 1 min,弃去消化液并加入适量含 10%FBS的 MEM培养基,反复吹打后制备细胞悬液,以 1∶4的比例传代。

1.3 染料木黄酮脂质体(GL)的制备方法 超声薄膜法制备 GL[1]。

1.4 GL对肿瘤细胞生长的影响 分别将 A549细胞和 HepG2细胞接种于 6孔细胞培养板中,每孔20 000个细胞。过夜贴壁后,实验组加入 GL(终浓度分别为 5、20、50μmol/L),对照组补加等体积的培养基,分别于第 24、48、72、96 h取样,台盼蓝活细胞拒染法计算各组活细胞数,绘制细胞生长曲线。于 96孔板中采用常规 MTT方法(作用 48 h),分别测定染料木黄酮及 GL对 A549和 HepG2细胞的体外增殖抑制作用,并计算 IC50。

2 结 果

2.1 GL粒度分布 将 GL适当稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明,脂质体平均粒径为136.7 nm,粒径分布范围窄,基本符合正态分布规律。

2.2 GL对 A 549和 HepG2细胞生长的影响 GL作用较长时间后,细胞生长明显受到抑制,且呈剂量依赖性。作用 24 h后,20μmol/L GL对 A 549和HepG2细胞的生长抑制率分别达 37%和 35%,50 μmol/LGL处理时生长抑制率可达 55%和 57%。结果见图 1。

图1 不同浓度 GL处理时 A549细胞(A)和 HepG2细胞(B)的生长曲线

2.3 染料木黄酮及 GL对 A549和 HepG2细胞的体外增殖抑制作用 MTT实验结果显示,染料木黄酮和 GL均呈剂量依赖性抑制 A549和 HepG2细胞的体外增殖;且 GL对细胞的增殖抑制作用强于游离染料木黄酮。GL对 A549和 HepG2细胞的 IC50分别为 10.46、12.34μmol/L,而游离染料木黄酮对 A549和 HepG2细胞的 IC50分别为 32.35、30.87μmol/L。结果见图 2。

图2 不同浓度 GL和游离染料木黄酮对 A549细胞(A)和 HepG2细胞(B)增殖作用的影响(n=3)

3 讨 论

目前认为染料木黄酮具有抗肿瘤作用机制有：①染料木黄酮可与雌激素竞争结合雌激素受体,从而减轻雌激素的促细胞增殖作用,降低与雌激素有关的肿瘤发病危险性[2];②染料木黄酮是酪氨酸蛋白激酶(PTK)的强抑制剂,对 PTK的抑制作用是其抗癌效应的重要分子机制[2];③染料木黄酮可抑制拓扑异构酶Ⅱ活性,引起肿瘤细胞的 G2/M期阻滞,诱导肿瘤细胞凋亡[3];④还可诱导谷胱甘肽过氧化物酶基因表达上调[4]。染料木黄酮是一种很有潜力的肿瘤化疗药物,具有广泛的应用前景,但其难溶于水,且具生殖内分泌毒性[5]、免疫毒性[6]、神经毒性[7]及遗传毒性[8]等多种毒副作用,限制了该化合物的进一步开发利用。

本研究制备了染料木黄酮脂质体,并对该制剂的稳定性及对肿瘤细胞的增殖抑制作用进行了观察,为将该化合物制备成免疫脂质体提供了实验依据。MTT实验结果显示,染料木黄酮脂质体对 A 549和 HepG2细胞的体外增殖抑制作用明显强于游离染料木黄酮,其 IC50大约是游离药物的1/3。其机制可能与肿瘤细胞摄取脂质体中药物的方式有关。脂质体主要通过细胞膜融合作用而被肿瘤细胞内吞,因而肿瘤细胞能有效摄取脂质体中药物,与游离药物进入细胞的方式相比,该方式能使肿瘤细胞内药物摄取量增加许多倍。

为进行染料木黄酮脂质体对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用研究,本研究中首先将制备的染料木黄酮脂质体用 0.22μm的微孔滤膜过滤,不可避免的造成了药物的损失。分析认为,可能与粒径较大的脂质体颗粒所能包裹的药物分子较多有关。需进一步改善脂质体的制备工艺,以减少粒径较大的脂质体的比例及因此造成的药物损失。

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