参附注射液对β淀粉样蛋白所致阿尔茨海默病大鼠认知行为和脑组织氧化应激的影响

李桂琼,柯大智

(重庆医科大学附属第二医院老年病科 400010)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一类以进行性认知障碍和记忆力损伤为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变,主要病理改变包括皮质神经元脱失、脑组织内老年斑和神经元内纤维缠结形成。随着人口老龄化,该病已成为威胁老年人生活质量的主要疾病之一,且发病率呈逐年上升趋势。AD的病因尚未阐明,仍然没有特效的治疗药物。

现有的研究表明,脑组织的氧化应激反应参与了AD的发生和发展[1-4]。参附注射液是红参、黑附片提取物的制剂,能增强心肌收缩力、增加心输出量(CO)、舒张冠状动脉及增加脑血流量。因此,临床上将SF作为治疗心力衰竭、休克、心肌梗死及肿瘤放疗、化疗的辅助用药,均取得了良好的疗效。同时,研究发现,参附注射液中的某些有效成分可以减轻脑组织的氧化应激,从而抑制神经元的损伤[5-6]。基于此,本研究采用β淀粉样蛋白(Aβ)侧脑室注射,观察其对AD大鼠认知行为及脑组织氧化应激的影响,探讨其对AD的疗效及其可能的作用机制,为SF临床治疗AD提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠30只(第三军医大学实验动物中心提供,SPF级),雌雄各半,体重(250±38)g,分笼饲养(10只/笼),自由摄食水。适应性喂养1周后,然后行水迷宫训练,训练动物学会迷宫为止。

1.1.2 药物与试剂 参附注射液(雅安三九药业有限公司生产,国药准字Z20043116);Aβ(Sigma公司生产)以蒸馏水溶解后保存于-20℃,避免反复冻融。临用前配成浓度为2μ g/μ L。SOD、GSH-PX、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。具体检测方法:SOD活力测定采用NBT法,其中每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位;GSH-PX活力测定测定采用DTNB法;MDA含量采用硫代巴比妥酸法检测。

1.1.3 主要仪器 RD1101-M型Morris水迷宫(上海移数信息科技有限公司生产);MP8000系列脑立体定位仪(深圳市瑞沃德科技有限公司生产);752型紫外可见分光光度计(南京第四分析仪器有限公司生产);3-18K型高速低温冷冻离心机(Sigma公司生产,Germany)。

1.2 水迷宫训练 水迷宫测试的原理:在定位航行试验中,AD大鼠潜伏期延长,单位时间内跨越原平台次数减少,表明其空间记忆力受损。以直径1.3m,高 50cm,水深30cm,水温(20±2)℃的水迷宫东、西、南、北4点为标记,将水迷宫分为4个象限。在东南象限正中放置一个透明平台,高约35cm,将其位置固定。以正西方向标记点为起步区,手提大鼠尾根部,从起步区将大鼠放入迷宫中,训练中每次大鼠游上平台后,让其在平台上休息60s以强化记忆。以连续4次大鼠在60s内游上平台作为大鼠学会迷宫的标准,给药2周后记录大鼠在水迷宫中潜伏期值。

1.3 分组及给药 AD大鼠模型的建立参见张文珺等[7]实验方法,具体如下:实验大鼠20%的乌拉坦(1.0g/kg)腹腔注射麻醉大鼠,麻醉后固定于脑立体定位仪上。颅顶正中矢状切开,行立体定位(前囟后3.5mm,中线旁开2.2mm,颅骨表面下3.1mm)。造模:正常对照组:用微量进样器吸取 DW 5μ L,缓慢注入侧脑室。Aβ组和Aβ+SF组:微量进样器吸取 Aβ 5μ L,缓慢注入侧脑室。注射结束后消毒局部注射部位皮肤,缝合皮肤,保温促其苏醒,正常喂养。Aβ+SF组SF腹腔注射,采用10mL/kg作为使用剂量,每日1次。正常对照组和Aβ组用等量生理盐水(NS)替代,连续14d,每日1次。术后给药2周,再次进行水迷宫测试,记录各组大鼠从起步区入水迷宫后到游上平台的时间,即为潜伏期。

1.4 组织取材及氧化应激指标测定 待给药2周水迷宫测试后2h,断颈处死大鼠,迅速取脑组织分离出海马和皮质,使用玻璃匀浆器在冰浴中制成10%的组织匀浆。而后将组织匀浆液以3 000r/min离心10min,取上清液按试剂盒说明处理,752可见光分光光度计比色法测定SOD、GSH-PX活力以及MDA的含量。

2 结 果

2.1 动物一般情况 观察动物精神、意识、行为、进食、进水等情况。造模前各组动物均反应良好。造模后,起初兴奋不安,随后出现反应迟钝、行动缓慢、嗜卧、饮食及饮水减少等。模型组还存在体重减轻、毛发干枯等现象。给予SF后,上述症状均有不同程度改善。

2.2 水迷宫检测大鼠行为学改变 相对于正常对照组(水迷宫潜伏期值:5.923±1.842),两周后模型组(Aβ组:24.368±5.759;Aβ+SF组:20.311±3.236)大鼠水迷宫潜伏期明显延长,表明Aβ所致AD模型建模成功;相对于模型对照组,Aβ+SF注射组可明显改善大鼠记忆力,缩短大鼠水迷宫潜伏期,且与模型组存在着差异,差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 各组大鼠皮质区相关自由基活力与水平 相对于模型对照组,SF可明显升高大鼠皮质匀浆中SOD、GSH-PX活力(P＜0.05),降低 MDA在皮质中蓄积量(P＜0.05)。表明 SF能明显增加大鼠皮质中SOD、GSH-PX的活力、减少M DA蓄积,从而减轻Aβ所致的氧化应激反应。见表1。

2.4 各组大鼠海马区相关氧自由基活力与水平 相对于模型对照组,SF同样可有效升高大鼠海马匀浆中SOD、GSH-PX活力(P＜0.05),降低MDA在海马区中蓄积量(P＜0.05)。表明SF同样能显著增加大鼠滑海马SOD、GSH-PX的活力、减少MDA的蓄积。见表2。

表1 各组大鼠皮质SOD、GSH-PX活力及MDA含量,n=10)

表1 各组大鼠皮质SOD、GSH-PX活力及MDA含量,n=10)

与NS组比较,*:P＜0.05,**:P＜0.01;与Aβ组比较,#:P＜0.05。

组别 n SOD活力(NU/mg)GSH-PX活力(NU/mg)MDA含量(nmol/mg)NS组 10 55.386±13.741 20.432±5.266 2.810±0.803 Aβ组 10 16.543±4.427** 11.975±3.101**4.833±1.008*Aβ+SF 组 10 21.039±5.101**#15.305±4.624*#3.729±0.896*#

表2 各组大鼠海马SOD、GSH-px活力及MDA含量,n=10)

表2 各组大鼠海马SOD、GSH-px活力及MDA含量,n=10)

与NS组比较,*:P＜0.05,**:P＜0.01;与Aβ组比较,#:P＜0.05。

组别 n SOD活力(NU/mg)GSH-PX活力(NU/mg)MDA含量(nmol/mg)NS组 10 33.461±10.089 18.665±4.378 2.039±0.571 Aβ组 10 23.227±5.143** 10.994±3.585**4.442±0.992*Aβ+SF 组 10 28.254±6.793*# 13.305±4.067*#3.218±0.835*#

3 讨 论

大量的研究证实,Aβ因其神经细胞毒性及在脑组织中的聚集,在AD的发病中占有十分重要的作用[8-11]。Korshunova等[12]研究发现,注射Aβ蛋白可导致记忆力损伤。在Aβ寡聚体的研究中,Watanabe等[13-14]发现,AD时Aβ寡聚体合并脑缺血可引起非凋亡性记忆力损伤,而该损伤与乙酰胆碱释放减少有关。有报道指出,在AD发生、发展过程中 Aβ与氧化应激关系密切[15-17]。氧化应激反应可以激活Aβ前体蛋白γ-分泌酶和β-分泌酶分裂的正反馈调节,从而促进Aβ蛋白的合成[18]。而Aβ蛋白可通过氧化应激的诱导从而引起钙调磷酸酶(依赖于钙调蛋白的丝氨酸-苏氨酸磷酸酶)的下调[16]。氧化应激和Aβ蛋白共同作用可导致大鼠神经元死亡、淀粉样沉积、黑质和记忆力的损伤[17]。同时,对于AD发病机制的研究,人们普遍认为脑内慢性炎症可能是其重要病理特征之一,从而提出了AD的相关炎症机制。

参附注射液的主要活力成分包括人参皂苷和乌头生物碱类,具有直接清除自由基和过氧化物,提高组织细胞的耐低氧和抗应激能力,可有效减轻脑缺血时的组织细胞损伤和再灌注损伤,同时降低血液黏度,减少血小板聚集而减轻脑缺血的发展。其强心、升压、稳压作用,可保证脑部灌注,同时能改善脑细胞对葡萄糖和氧的摄取,促进ATP的合成,改善病变组织的细胞能量状态,有利于神经功能的改善以及智能的恢复。鉴于此,在本研究中采用Aβ蛋白侧脑室注射复制AD大鼠模型,随后使用临床上广泛运用的参附注射液作用于AD大鼠,观察其对AD大鼠记忆力及氧化应激相关因子的影响。

研究表明,参附注射液中的有效成分之一人参皂苷Rg1可有效减轻Aβ短肽(25-35)所诱导的AD小鼠的学习和记忆力损伤[19]。在随后的研究中,Chen等[6]也发现,人参皂苷Rg1可通过抑制氧化应激而减轻AD小鼠黑质神经元的损伤。在人参皂苷Rd中也发现,Rd可减轻衰老小鼠脑组织的氧化应激[20]。

正常情况下,机体的抗氧化能力与氧化能力之间保持着动态平衡。若自由基产生过多或抗氧化能力下降,将导致机体损伤。大量氧自由基的产生可直接损伤线粒体、溶酶体内质网等,同时还可损伤细胞DNA等结构,促进某些疾病的发生、发展。而体内的SOD、GSH-PX则可有效地清除自由基,减轻组织损伤。SOD与GSH-PX协同作用清除机体过多的自由基及有机过氧化物[21-22]。而脂质过氧化的最终产物如M DA可与DNA、RNA、蛋白质、磷脂等物质结合,损伤细胞膜,引起神经系统功能障碍,同时其细胞毒性作用是导致AD神经元变性坏死的重要原因[23]。

在本研究中,观察到相类似的现象,即参附注射液明显缩短大鼠迷宫潜伏期,改善AD大鼠记忆力;在检测相关氧自由基水平时,作者发现参附注射液可效增强SOD和GSH-PX的活力,减少有毒物质MDA在脑组织中的蓄积,从而减轻脑组织中氧化应激反应,保护皮质、海马的神经元,进而恢复AD大鼠的记忆力和认知力,达到改善AD动物记忆力的目的。

事实上,参附注射液是通过直接抑制氧化应激中相关自由基,还是通过某些信号途径降低Aβ所诱导的AD中的氧自由基水平,尚不是很清楚,这值得进一步研究。

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