猪圆环病毒分子生物学研究进展

叶 芬，蔡家利

（1.西南大学动物科技学院，重庆 400715；2.重庆理工大学化学与生物工程学院，重庆 400050）

1 病毒基因组结构及其编码的主要蛋白

1.1 病毒的基因组结构和特点 PCV基因组为单链环状DNA分子，根据PCV的致病性、抗原性及核酸序列，将PCV分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1的基因组全长为1 759bp，基本没有致病性，PCV2的基因组全长为1767bp或1768bp。两个血清型的核苷酸的同源性低于80%，由基因序列推出的氨基酸的序列同源性小于76%。PCV2分离株间核苷酸的同源性大于94%，而PCV1分离株间核苷酸的同源性大于99%。

PCV基因组中含有圆环病毒所特有的茎环结构（Stem-loop structure），它是一保守的9核苷酸基序，序列为 TAGTATTAC（PCV1）或 AAGTATTAC（PCV2），这一序列对病毒DNA的复制非常关键，DNA的环复制就是从这里开始。茎环结构下游有4个六聚体重复（5′-CGG-CAG-3，H1 H2 H3 H4），这些序列是病毒复制酶蛋白的结合位点。

Hamel等（1998）应用软件对PCV基因组进行分析，发现PCV1和PCV2均可能含有11个开放阅读框（ORF）。其中 ORF1、2、3、4、7和 8具有一定的同源性，其余ORFs无任何同源性。编码的蛋白大小从36 kDa～2 kDa不等。现已证实，PCV有两个主要的阅读框:ORF1和ORF2，二者在长度上都大于600bp。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，该蛋白氨基酸序列相当保守，是PCV1和PCV2产生抗原交叉性的主要原因；而ORF2编码病毒的主要结构蛋白Cap，它是主要的免疫蛋白。

PCV2基因组的11个阅读框大小相差悬殊（见表1）。其中 ORF1、ORF5、ORF7、ORF10，5′～3′方向相同；ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11，5′～3′方向相同。这些阅读框表现为重叠基因，从而充分利用了圆环病毒有限的遗传物质，这可能是生物进化过程中自然选择的结果。

表1 PCV2基因组的阅读框概况

1.2 病毒编码的主要蛋白

1.2.1 Rep蛋白 Rep蛋白与病毒基因组的滚环复制相关，由PCV最大的开放阅读框ORF1编码，分子量为 35.6 kDa（PCV1） 或 35.8 kDa（PCV2），由 312 aa（PCV1）或 314 aa（PCV2）组成。PCV1与 PCV2的蛋白氨基酸序列同源性达86%，这也是两种血清型PCV产生抗原交叉性的主要原因所在。PCV1的Rep蛋白仅有 1 个糖基化位点，位于 20 aa～22 aa（NPS）；PCV2 的Rep蛋白则含有3个糖基化位点，位于23 aa～25 aa(NPS)，256aa～258aa（NQT）及 286aa～288aa（ZAT）。Rep蛋白具有与典型滚环复制（RCR）相关的3个保守基序Ⅰ（FTLNN）、Ⅱ（HLQG）、Ⅲ（YCSK）以及结合 dNTPs的P环（P-LOOP）结构（序列为G-GKS），这些结构对维持Rep蛋白的功能至关重要，突变或缺失均会影响病毒的复制，这也进一步证明了PCV DNA是滚环式复制。Rep蛋白在所有圆环病毒中相对保守。系统发生学分析表明，圆环病毒的Rep蛋白可能是植物病原Nanovirus的Rep蛋白与小RNA样病毒（如嵌杯样病毒）RNA结合蛋白或原核生物的解旋酶发生重组的结果。

1.2.2 Cap蛋白 实验证明ORF2编码病毒的结构蛋白（Cap蛋白），它是病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，在病毒感染细胞后在宿主各种酶的参与下产生。PCV1与PCV2的Cap蛋白均由233aa组成，氨基酸同源性仅为64%。两种病毒的Cap蛋白都只有单一的糖基化位点，分别位于PCV2 Cap的143 aa～145aa（NYS）及 PCV1 的 102aa～104 aa（NYS）。

Nawagitgul等将ORF2基因克隆后于昆虫细胞中表达，表达产物的分子量为30 kμ，与从纯化的病毒粒子中监测到的蛋白大小相似，电镜观察发现表达产物能自动组装成病毒核衣壳样颗粒，从而进一步证实ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白。血清学实验显示，两种血清型的Cap蛋白没有抗原交叉性，这可能是因为这个共同抗原位点给整个Cap蛋白给掩盖了。通过多肽扫描还发现，PCV2 Cap蛋白上存在三个特有的抗原位点（65aa～87aa，113aa～139aa及 193aa～207aa），这为建立特异性检测PCV2的血清学方法奠定了基础。目前，对PCV研究较深入的为ORF1和ORF2，同时由于ORF2的以上特性，其编码产物就成为分子水平上诊断PCV的理想抗原，ORF2也成为研制基因工程疫苗的首选基因。因此，ORF2的研究已成为PCV2研究的热点。

2 PCV2分子免疫学特性

有研究表明，PCV2能够在其不复制或降解的情况下持续存在于DC细胞中，这种沉默病毒的感染同时提出了免疫逃避和DCs降解机制，而由于具有迁移能力，感染病毒的DCs是一种潜在的可在宿主体内不需要复制就能传播病毒的工具。Shibahara等也证实PCV2可以诱导淋巴系统中B细胞凋亡，使得抗原递呈细胞递呈抗原的能力减弱，同时降低了B淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的机能，因此PCV可以导致猪的免疫抑制。由于PCV2导致细胞因子mRNA表达失调，尤其是胸腺Ⅱ-10mRNA水平上升，必然严重损害猪群的免疫系统，从而为其他病原的侵袭创造了有利条件。

3 与分子生物学相关的检测方法研究进展

3.1 ELISA方法 林彦星等应用原核表达的PCV2衣壳（Cap）蛋白作为诊断抗原，初步建立了一种检测PCV2抗体的间接ELISA方法。实验表明该方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。秦承学等将PCV2 ORF1和ORF2基因分别插入杆状病毒和大肠杆菌表达系统，用亲和层析方法提纯获得重组衣壳（Cap）与复制（Rep）蛋白，用细胞融合技术获得2株Cap和Rep蛋白单克隆抗体，以重组Cap和Rep蛋白作为抗原，通过反应重要条件的优化，建立了间接ELISA方法，有较好的特异性和重复性，可用于PCV2抗体检测和疫苗免疫抗体鉴别诊断。

3.2 间接免疫荧光试验（IFA） 1998年Allan等将组织病料在PK215细胞中进行培养，用兔抗PCV高免血清培养细胞中的PCV进行反应，利用间接免疫荧光法对PCV进行检测和分型。该方法具有良好的特异性和敏感性，可满足流行病学调查、临床监测和疫苗抗体水平检测的需要。

3.3 PCR方法 PCR法是一种诊断快速和特异性高的诊断方法。目前用于PCV诊断的PCR法主要有常规PCR、复合PCR、套式PCR、竞争PCR等方法。Quintana等对18种猪商品疫苗用PCR检测PCV1和PCV2，结果发现所有疫苗中未含有PCV2 DNA，仅有其中两种疫苗检出PCV1。此结果证明，PCR是检测疫苗产品中是否含有外源PCV的快速敏感的方法，可用于猪疫苗质量控制。冯志新等研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，特异性扩增PCV2-ORF2基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法。该方法具有较好的特异性和重复性，对PCV2 DNA检测的下限为1拷贝/μL，敏感性比常规PCR高106倍。

目前在规模化、集约化猪群中发生多病原混合感染、继发感染的情况越来越常见，其中PCV2、猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）是较易混合感染的DNA病毒，常见于临床病例中。由于多重PCR技术可在一份样品中同时检测多种病原体，且特异性和敏感性高，检测时间短、成本低，在国外已作为一种新的检测方法被应用于临床病例的检测中。Lee Chulseung等构建了可检测和区分PRV、猪细胞巨化病毒（PCMV）和PCV2的多重PCR方法，此法对其他病毒、细菌和所用的Vero细胞未见有非特异性反应，适用于检测供异种组织器官移植的猪样品中的这些病毒。

3.4 原位杂交（ISH）技术 ISH具有高度敏感性，在国内外已经建立了多种方法。应用ISH既可以对PCV1和PCV2进行分型，又可以检测PCV与其他病毒的混合感染。刘方娜等根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）基因序列，在ORF2内设计1对特异性引物，利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段，回收并纯化PCR产物，用地高辛标记，建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV2的方法。该探针与8个PCV2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交，而与对照组猪圆环病毒Ⅰ型（PCV1）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）的核酸杂交均为阴性；对PCV2 DNA的最低检测量为10pg。

4 结语

自猪圆环病毒（PCV）发现以来，各国学者对其进行了深入研究。目前，PCV2及由其引起的PMWS等疾病已成为当今的研究热点，也取得了不小的进展，但仍有许多问题尚待解决。由于目前仍然无有效的措施来防制猪圆环病毒病，所以仍需对PCV的分子生物学特性进行深入研究，以进一步弄清病毒基因组各ORFs及其编码的蛋白质的结构与功能、病毒的免疫学特性以及病毒的致病机理等，为PCV2的弱毒疫苗、亚单位疫苗以及重组活载体等疫苗的研制奠定坚实的理论基础，力争从根本上解决该病的防制问题。

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