经皮球囊封堵冠状动脉法制备小型猪心肌梗死模型及评价*

彭朝权， 王景峰， 杨 珂， 张成喜， 何 可， 康 庄， 刘金来， 程木华， 邹丽媛

(中山大学附属第三医院1心内科，2放射科，3核医学科，广东 广州 510630;4中山大学附属第二医院心内科，广东 广州 510120)

动物模型被广泛应用于研究人类疾病，动物心肌梗死模型是研究冠心病发病机制和治疗方法的重要工具。目前，用于建立心肌梗塞模型的常用实验动物主要有:猪、犬、兔、羊、大鼠等。由于猪的心脏解剖、冠脉循环与人类似，特别是猪的血液黏稠度大，冠脉侧支交叉分布较少，不易建立侧支循环，故成为建立心肌梗死模型良好的选择［1］。目前，建立心肌梗死动物模型的方法主要有:结扎法、球囊封堵法、栓塞法、血栓形成法、药物法、冷冻法、选择性饮食法及Ameriod环套扎法等。其中后两者属慢性心肌梗死模型［2］。球囊封堵法能够减少实验动物创伤，并能最大程度模拟临床实际情况，但术中室颤和血栓形成等因素限制了该模型的应用［3］。本文主要就球囊封堵法建立急性心肌梗死模型的可行性及注意事项进行探讨，以提高建立小型猪心梗模型的成功率。并以此心梗模型初步探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植治疗心肌梗死的效果。

材料和方法

1 实验对象

8－12个月的成年小型藏猪(质量合格证为 No.0038589)，雌雄不限，体重33－36 kg，购自南方医科大学动物实验中心。

2 材料

2.1 介入材料 桡、股动脉穿刺针，6F动脉鞘，各种导丝(造影导丝，指引导丝)，各种指引导管{6F左冠状动脉指引导管(JL4.0)，6F右冠状动脉指引导管(JR4.0)}，各种球囊(2.5 mm×15 mm、2.5 mm×18 mm)，压力泵及换能器等。

2.2 监护及抢救材料 监护仪，心电图机，除颤器，小手术包，气管切开包，鼻导管，抢救药品，麻醉药品。

3 麻醉过程

3.1 药物 速眠新Ⅱ，规格为1.5 mL/支的注射液，购自军事医学科学院军事兽医研究所，批号为吉兽药(2004)005013。戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司进口分装，25 g瓶装粉剂，批号为F20030816。用生理盐水配置成3%戊巴比妥钠溶液，过滤消毒备用。地西泮注射液:规格为2 mL∶10 mg/支的注射液。

3.2 麻醉方法

①诱导期 动物术前8 h禁食，动物一般情况良好，无烦躁不安，无嗜睡淡漠，无呕吐，肢体活动良好，血运正常。称重，按0.1 mL/kg剂量速眠新Ⅱ联合0.6 mg/kg剂量地西泮注射液臀部肌内注射。给药后几分钟即表现为四肢无力、步履蹒跚、头颈下垂、不能避让障碍物进而卧倒在地，全身肌肉松弛，痛觉消失。平均诱导期为30 min。

②维持期 将猪仰卧位固定双上肢于特殊木架上，双下肢于手术台上，充分暴露双侧腹股沟。再以0.3 mL/mg的剂量耳后肌肉内推注3%戊巴比妥钠生理盐水溶液。在维持期表现痛觉和触觉消失，瞳孔散大，腹式呼吸，肌肉松弛，手术切割和内脏牵拉无反应。视术中动物肢体反应于1－1.5 h追加3%戊巴比妥钠生理盐水溶液5－10 mL。保持麻醉状态，监测其生命体征。

③苏醒期 术后基本生命体征稳定后，不再追加麻药，等待其自行苏醒。

4 心肌梗死模型建立方法

4.1 术前准备 固定体位后，耳缘、胸部、四肢局部去毛，接心电监护。用套管针在猪耳缘静脉建立静脉通路，持续静脉滴注5%葡萄糖生理盐水溶液，维持体液平衡。预防性使用抗心律失常药物，胺碘酮300 mg、利多卡因500 mg于5%葡萄糖生理盐水静滴。做术前心电图，接胸导联及肢体导联。观察心电图，理想心率应低于110 beats/min，无期前收缩及传导阻滞。

4.2 冠脉造影及球囊置入 常规消毒铺巾，取猪右侧腹股沟部位，可采用经皮穿刺或切开分离出股动脉直接穿刺。经皮穿刺时触及股动脉搏动最强处，右手持针对准该点斜行平刺入，穿刺成功可见动脉血色鲜红自针尾喷出，送入导丝。也可切开皮肤，钝性分离暴露右侧股动脉穿线，穿刺针小心刺入股动脉，通过穿刺针送入导丝，沿导丝送入6F动脉鞘管，随即弹丸式静脉注入肝素10000 U，手术过程中每隔30 min追加肝素2000 U。经动脉鞘置入6FJL4指引导管。经该导管置入球囊导丝至左前降支(left anterior desending coronary artery，LAD)远端，经该导丝置入直径为2.5 mm×15 mm的球囊至第一或第二对角支远端，以2－4个大气压打开球囊(根据冠脉的直径大小选择，以球囊扩张后造影远端血流中断为标准)，预适应5－7次，第1次1 min，第2次2 min，第3次5 min，每次间隔5 min，第4次10 min，第5次15 min，第6次20 min，第7次30 min，每次间隔10 min。预适应期间可预防性使用抗心律失常药。观察球囊堵闭过程中动脉内压力、心电图ST－T变化及有无心律失常等。如出现频发室早、短阵室性心动过速或心室颤动等情况可考虑延长预适应时间，如无异常，则以2－4个大气压打开球囊堵闭LAD，造影示球囊远端血流中断，持续90 min之后，缓慢释放球囊(0.5atm/5－10min)。再次造影观察血供情况，血供良好退出鞘管，压迫止血。术中连续心电监护及鼻导管氧气吸入，监测心电图、心率、呼吸、有创压、血氧饱和度，发现异常时，立刻采取相应措施。

4.3 术后护理 术后抗生素肌注3 d预防感染，第2 d恢复进食。

5 心梗模型成功的指标

心梗前后行心电图(electrocardiogram，ECG)检查，心梗后行超声心动图(echocardiography，UCG)、心肌核素显像(single photon emission computed tomography，SPECT)、最后处死小型猪行梗死部位的病理检查以证实心肌梗死已经发生。

6 MSCs移植

将造模成功的10只小型藏猪随机分为2组，MSCs移植组5只，采用OTW球囊移植MSCs到心梗部位，生理盐水组5只，以相同方法注射生理盐水。8周后比较2组的左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和短轴缩短率(fractional shortening，FS)、左室舒张末期内径(end diastolic volume，EDV)和左室收缩末期内径(end systolic volume，ESV)的变化。

7 统计学处理

结 果

1 球囊封堵情况

经皮球囊封堵成功阻断LAD中远段血流情况见图1、图2。

Figure 1.Normal blood flow of coronary artery angiography before ballon occlusion.图1 球囊封堵前的冠脉造影显示血流正常

Figure 2.No blood flow of middle－distal segment in LAD by coronary artery angiography after ballon occlusion.图2 球囊封堵后的冠脉造影LAD中远段血流被球囊完全阻断

2 ECG检测

小型猪心肌梗死前后ECG变化见图3、图4。

Figure 3.Normal ECG of mini swine before ballon occlusion.图3 球囊封堵前正常小型猪的ECG

Figure 4.STV1－V5drive up ECG of myocardial infarction in mini swine after ballon occlusion.图4 球囊封堵后心肌梗死小型猪的ECG3UCG和ECT检测

心肌梗死小型猪的心脏超声和心肌核素显像表现见图5、图 6。

Figure 5.Apex and septa were thin，movement was weak detected by UCG.图5 UCG示心尖和室间隔变薄、运动减弱

Figure 6.Perfusion defect of apex and septa detected by SPECT图6 ECT示心尖和室间隔核素灌注充盈缺损

4 病理改变

小型猪正常心肌和梗死心肌的病理变化，见图7、8。

Figure 7.Normal myocardium tissue.图7 正常心肌组织

Figure 8.Myocardial cell edema，profile illegibility and nucleus discharge of part cells were observed.图8 心肌梗死后可见心肌细胞水肿，组织轮廓模糊，部分细胞核逸出胞质

5 成功率及术中并发症

20只猪均成功完成冠脉造影，经皮球囊封堵法成功制备小型猪心肌梗死模型10只，均经过ECG、UCG、ECT和病理证实，成功率50%。死亡10只，其中4只分别于球囊封堵过程中诱发心室纤颤死亡，2只封堵结束时球囊释放过快，致再灌注心律失常出现心室纤颤死亡，1只因指引导管深插入冠脉开口内，刺激冠状动脉痉挛，诱发心室纤颤死亡。1只因麻醉过深至呼吸抑制死亡，1只因麻醉不佳猪躁动致指引导管穿破左冠状窦急性心包填塞，心室纤颤死亡，1只疑肝素用量不足至冠脉内血栓形成，血压下降，心室纤颤死亡。

6 UCG检查结果发现

与造模之前比，心梗后左室舒张末期内径(EDV)和左室收缩末期内径(ESV)显著延长，左室射血分数(LVEF)和短轴缩短率(FS)显著下降(P＜0.05)，室壁活动减弱。8周后，MSCs移植组均较移植前好转(P＜0.05，P＜0.01)，而生理盐水组亦有所改善，但无显著差异;MSCs移植组的EDV和ESV较生理盐水组明显减少(P＜0.05，P＜0.01)，MSCs移植组的LVEF和FS较生理盐水组明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，见表1，MSCs移植组的室壁活动较生理盐水组好转。

表1 超声心动图测定心功能的指标Table 1.Index of left ventricular function by UCG examination(.n=5)

表1 超声心动图测定心功能的指标Table 1.Index of left ventricular function by UCG examination(.n=5)

＊＊P ＜0.01 vs baseline;△P ＜0.05;△△P ＜0.01 vs 1 week after myocardial infarction.

n LVEF(%)Baseline 82.75 ±6.43 82.34 ±5.951 week after myocardial infarction 63.06 ±4.89＊＊ 60.73 ±4.16＊＊8 weeks after myocardial infarction 68.63 ±5.62 78.98 ±5.86△EDV(mL)Baseline 45.68 ±5.86 43.93 ±5.421 week after myocardial infarction 67.53 ±8.94＊＊ 65.19 ±7.69＊＊8 weeks after myocardial infarction 69.86 ±7.64 46.31 ±6.18△△ESV(mL)Baseline 8.65 ±2.40 7.73 ±2.151 week after myocardial infarction 24.64 ±3.83＊＊ 25.62 ±4.74＊＊8 weeks after myocardial infarction 19.68 ±3.29 11.84 ±2.96△FS(%)Baseline 51.42 ±5.36 50.67 ±5.241 week after myocardial infarction 33.74 ±3.78＊＊ 32.85 ±3.41＊＊8 weeks after myocardial infarction 38.28 ±4.35 47.84 ±4.93△△

讨 论

多年来动物心梗模型一直沿用开胸结扎法［4］，此法对动物创伤较大，术后难饲养，恢复慢，死亡率高［5］，随着介入技术的飞速发展，使得经皮球囊封堵术制备心梗模型变为可能，本研究采用的是经皮球囊封堵术，它简便易行，创伤小［6］;且相比较开胸结扎法，心梗相关血管还可以再利用，比如通过该血管注射药物或将骨髓干细胞移植到梗死区，进行更多领域的研究等。

西藏小型猪是我国目前已知小型猪中体重最轻的品种之一，是一种理想的实验动物［7］。在解剖学方面，猪的心脏结构及冠脉走行也与人有独特的相似性。西藏小型猪与人类的血液生理指标及血液生化指标的比较，与其它实验动物如犬、猕猴，差异是最小的。尤其是CHOL和TG指标与人类接近，可能更适合用于人类器官移植的供体、制作心血管方面的疾病动物模型等等。但是藏猪的红细胞数和血红蛋白偏高，可能与藏猪来自高原环境有关。血小板 PLT在(424.62±172.21)×109/L，高出人类正常值范围，且有显著差异。西藏小型猪的红细胞压积(HCT)高于人类且有显著差异。这说明西藏小型猪的血液较黏稠，凝血功能较人类强。因此，在制备心梗模型时要特别注意加强抗凝治疗，本文在开始造模时没有特别注意这一点，结果有1只猪因冠脉广泛血栓形成而导致死亡，在以后的造模过程中注意大剂量肝素抗凝和30 min追加肝素，就再也没有发生血栓事件。

本文造模的成功率为50%，与孙帅等［8］报道的结果相似，死亡主要发生在造模初期，主要死于心室纤颤。待一切条件摸索成熟后，很少再出现动物死亡。在本实验中，选取的小型猪体重在30－40 kg之间，方便操作，且动物有一定的耐受力。术前动物应具备良好的一般生命体征，是实验成功的前提条件。理想的动物生命体征包括心率平均为(110.96±29.37)beats/min，根据在实验中的体会，应维持术中心率小于110 beats/min、呼吸20 beats/min、血压平均120/80 mm-Hg比较理想。

实验的进行应有良好的麻醉作为保障。在实验初期，有1只猪麻醉效果不稳定，术中肢体摆动，烦躁不安，体位固定不佳。在球囊封堵20 min时，血压由156/120 mmHg迅速下降至20/20 mmHg，造影剂在冠脉开口处向四周扩散，心包穿刺出不凝血，术后尸检发现在冠脉开口附近有一破裂口贯通主动脉管壁。考虑为麻醉过浅，猪肢体摆动，指引导管刺破管壁，诱发急性心脏压塞。另有1只因麻醉过深导致呼吸停止而死亡。本实验中，麻醉采用的是地西泮、速眠新Ⅱ联用戊巴比妥钠生理盐水溶液肌肉注射。速眠新注射液为氟哌啶醇、保定宁、新保灵、氯胺酮等药物制成的复方制剂。具有中枢性镇痛、镇静和肌肉松弛作用，具有起效快特点。但由于麻醉维持时间短，常被用作大动物手术前诱导麻醉［9］。戊巴比妥钠属于巴比妥酸钠的衍生物，属于中效催眠药，随着剂量从小到大，依次会出现镇静、催眠和麻醉作用。该药具有静脉注射起效快、麻醉过程平稳，维持时间较长，术后恢复快等特点，但其安全范围较窄，对呼吸和循环系统有严重抑制，会出现血压降低。联合使用可以减少单独使用每种药物的剂量，进而降低药物对动物的副作用，减少其在动物体内因麻醉药蓄积造成的麻醉意外［10］。行腹腔麻醉效果不佳，是由于腹腔注射后药物在腹腔内被腹水稀释后再缓慢吸收，血液达到有效浓度的时间较长，静脉麻醉又不易控制给药速度，不易控制麻醉深度。小型猪肌肉注射药物先弥散入肌肉组织再进入血液循环，可起到一定的缓冲作用，有利于麻醉深度的控制。耳后肌群松软，神经反射不敏感，更利于给药和缩短诱导时间。术中每隔30 min－1 h追加初始剂量的1/3－1/4，有效维持麻醉。

实验猪心脏与体重的比值接近人类。有左右2条冠状动脉起自升主动脉根部，位于主动脉瓣上方。2条冠脉直径相似，但与人相比，侧枝循环较少。左冠状动脉走行于肺动脉与左心耳之间，在到达锥旁室间沟前分为锥旁室间支和回旋支。前者发往心尖，类似于人类的左前降支LAD。它和右冠脉提供约80%的心肌血供。左冠脉分支供应左心房、右心室、左心室、室间隔。猪的这些特殊的生理结构使其在进行心脏导管介入和心肌内注射实验时易诱发心律失常、冠脉痉挛、血栓形成、心室纤颤、心脏停搏和猝死。在本实验中，心室纤颤的发生率为45%，且一旦发生室颤，抢救成功很低。综合室颤发生的原因，有以下几个方面:首先，急性缺血后折返环形成、触发活动、自律性升高构成了室性心律失常的物质基础［11］。其次，相比其它动物种属，猪本身室颤阈值较低，缺血后容易诱发室颤［12］。另外，与人类急性心梗发生在粥样斑块基础上不同，模型动物冠状动脉本身正常，球囊封堵后心肌细胞缺乏缺血预适应过程，容易发生心律失常［13］。

因而在实验中我们应采取如下措施降低室颤的发生率及死亡率:(1)麻醉适当，既不能过浅，也不宜过深。(2)肝素用量宜大，且于造模术中定期追加，才能预防血栓形成。(3)球囊封堵位置不宜过高，由于猪的LAD支配范围广，而侧枝循环少，高位阻断会扩大心梗面积，超出猪的耐受能力。我们选用封堵点在左前降支第二对角支远端，既可以达到满意的实验效果又可以保证存活率。(4)造模前和造模过程中，预防性静脉给予利多卡因和胺碘酮，从而有效预防心律失常的发生。(5)造模开始时，适当延长预适应时间和次数。(6)造模成功后，缓慢释放球囊可明显减少再灌注心律失常的发生。一旦发生恶性心律失常，则应立即进行紧急处理。如出现室性早搏时，立即加大利多卡因和胺碘酮的用量。如出现室性心动过速，立即静脉注射利多卡因和胺碘酮。对于心室颤动，立即给予360J体外除颤，胸外按压，直至恢复窦性心律。经过实验前期的经验积累，实验后期我们采用了以上预防措施，大大减少了室颤的发生率，提高了造模的成功率。

本文采用了造模成功的小型藏猪，观察了MSCs经冠脉移植对小型藏猪梗死心肌的疗效，MSCs移植组和生理盐水组的基线LVEF、FS、EDV、ESV均无显著差异，2组造模1周的LVEF、FS均较造模前明显降低(P＜0.01)，但2组比较无显著差异(P＞0.05)。EDV、ESV均较造模前明显增大(P＜0.01)，但2组比较无显著差异(P＞0.05)，即2组小型藏猪的心梗模型具有可比性。MSCs移植组8周时LVEF、FS较心梗1周时明显增加(P＜0.05)，EDV、ESV均较心梗1周时明显减少(P＜0.01)，而生理盐水组移植8周时LVEF、FS较心梗1周时有所增加，EDV、ESV均较心梗1周时有所减少，但均无显著差异(P＞0.05)，心梗8周时MSCs移植组较生理盐水组的 LVEF、FS明显增加(P＜0.05，P＜0.01)，EDV、ESV 明显减少(P ＜0.05，P ＜0.01)，说明 MSCs移植治疗心肌梗死是有效的，同时也进一步说明经皮球囊封堵冠状动脉法制备的小型猪心肌梗死模型适合进行骨髓干细胞移植的研究。

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