正交实验法优化沙棘黄酮的提取工艺*

侯 霄

(山西省医药与生命科学研究院中药室,山西太原 030006)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名沙枣、醋柳、酸刺等,是我国蒙医、藏医传统习用药材。1977年首次被卫生部正式收载于 《中国药典》,之后又被颁布为药食两用品种,具有活血散瘀、止咳祛痰、消食化滞的功效[1]。沙棘在我国药用历史悠久,早在唐代 《月王药诊》、《四部医典》和清代 《晶珠本草》中均记载了沙棘的医药用途。沙棘黄酮是沙棘总黄酮 (Total flavones of Hippophae rhamnoides L.)的简称,是沙棘中含有多种黄酮成分的一组化合物,主要包括槲皮素、异鼠李素、山奈酚及其苷类芦丁等成分[2]。沙棘黄酮是沙棘中的重要活性成分,具有抗心肌缺血、抗心率失常,提高耐缺氧能力、降低血清胆固醇、抑制血小板聚集、促进创伤面的愈合、提高免疫力、抗氧化、抗辐射等广泛的药理功效[3]。为了提高产品质量,保证药品疗效,本文对沙棘黄酮的提取工艺进行正交试验研究,从中优选出最佳提取工艺条件,为制剂工业化生产提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

290SCS电子天平 (瑞士PRECISA),GZX-9076MBE电热恒温鼓风干燥箱 (上海博迅),HH-4恒温水浴锅(常州国华),SHB-Ⅲ循环水式真空泵 (郑州长城),UV757CRT紫外可见分光光度计 (上海精科),RE5298A旋转蒸发器(上海亚荣),HC-3518高速离心机 (科大创新)。

1.2 材料

沙棘果于2008年10月采自山西省沁源县鱼儿泉产地,芦丁标准品购于中国药品生物制品检定所 (批号100080-200707,含量92.5%),乙醇、石油醚 (60～90℃)、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯,试验用水为蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 实验材料预处理

2.1.1 备料

取上述自然干燥的沙棘果洗净,置鼓风干燥箱60℃烘干,粉碎,过20目筛,药粉密封,放入干燥器中备用。试验开始前用感量0.1g天平准确称取沙棘果粉5.0g,设计16个正交试验组合,重复3次,共计称量48份实验材料。

2.1.2 脱脂

正交实验前先用石油醚 (沸程60～90℃)脱脂两次,第1次:将称量好的沙棘果粉5.0g装入100ml烧瓶中加入40ml石油醚,安装回流提取装置,水浴加热70℃提取1.5h,取下烧瓶,过滤,分离原料与石油醚提取液。第2次:将上述石油醚提过一次的原料加入30ml石油醚,水浴加热70℃,回流提取1h,过滤,合并两次石油醚过滤液,放入另外的容器中保存备用。

2.2 正交实验

2.2.1 正交实验设计

根据单因素预实验结果,并参考文献资料报道[4],确定以80℃为乙醇提取温度,以沙棘总黄酮含量为评价指标,综合考察影响乙醇回流提取沙棘黄酮的主要因素,如:乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数4个因素,每个因素分别设计4个不同水平,最后确定因素水平见表1、正交试验方案见表2。通过L16(45)正交试验筛选研究,最终优选出沙棘黄酮提取工艺的最佳条件。

表1 因 素 水 平 表

表2 L16(45)正交试验安排与结果

2.2.2 样品溶液制备

分别取上述称量、脱脂后的沙棘果粉原料,按照表2 L16(45)正交表具体工艺条件,进行4因素4水平的组合实验,重复3次。分别收集每一组号的抽滤液,离心5min(10000r/min),离心液加入250ml容量瓶中,以相应提取时的乙醇浓度定容,摇匀。分别精密量取 25ml加入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容,摇匀,作为供试品溶液。

2.3 含量测定

按照2005年版药典一部沙棘项下总黄酮含量测定方法进行。

2.3.1 对照品溶液的制备

精确称取在120℃下干燥至恒重的芦丁对照品20.08mg,置于50ml量瓶中,加入适量60%乙醇,置水浴上微热使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,摇匀。精确量取25ml,置50ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即得 (每1ml中含无水芦丁0.19mg)对照品溶液。

2.3.2 标准曲线的制备

精确量取对照品溶液 1ml、2ml、3ml、4ml、5ml与6ml,分别置于25ml量瓶中,各加30%乙醇溶液至6ml,加5%亚硝酸钠溶液1ml,摇匀,放置6min,再加10%硝酸铝溶液 1ml,混匀,放置6min,加氢氧化钠试液10ml,再加30%乙醇至刻度,摇匀,放置15min,以相应试剂为空白,照紫外可见分光光度法,在500nm的波长处测定吸光度,试验结果见表3。以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线见图1,计算得直线回归方程:A=0.4105C-0.0165(r=0.9967)。

表3 芦丁标准曲线的测定

图1 芦丁标准曲线

2.3.3 样品溶液的测定

分别在上述2.2.2制备的50ml量瓶中量取3ml供试品溶液,置于 25ml容量瓶中,各加30%乙醇3ml至6ml,照标准曲线制备项下的方法,自 “加5%亚硝酸钠溶液1ml”起,以相应试剂为空白对照,依法测定吸光度。通过上述2.3.2得到的直线回归方程,分别计算出各实验组合的浓度。

总黄酮含量=提取的总黄酮质量/沙棘果粉质量=CV/W

即可求出各实验组合的总黄酮含量,结果见表2。分别对其进行极差分析和方差分析,结果见表4。

表4 方差分析

3 讨论与小结

(1)目前从沙棘中提取总黄酮的方法一般有水浸提取、有机溶剂提取、超临界CO2流体提取、微波法提取和超声波法提取等,用水浸提取沙棘总黄酮提取率一般偏低,超临界CO2萃取适用于非极性化合物的分离,微波法和超声波法提取目前仅限于少量提取实验,还不具备工业化大生产,有机溶剂提取中甲醇和丙酮含有毒成分,因此,用乙醇提取沙棘黄酮是目前适合工业化大生产的安全适宜方法。

(2)在用乙醇提取之前先用石油醚预处理沙棘原料,这样提取液可生产沙棘油,同时可除去油脂、色素等杂质,以免影响后续黄酮的提取与测定。

(3)2005年版 《中国药典》规定:沙棘果以干燥品计算,含总黄酮以无水芦丁计,不得少于1.5%。在本文的16个正交实验提取组合中,除15号、16号沙棘总黄酮含量低于1.5%外,其余14个组合沙棘总黄酮含量均高于1.5%,最高达2.94%,说明山西沁源沙棘果黄酮含量较高。同时,初步说明沙棘黄酮极性较大,不适宜高浓度乙醇提取,并且只用乙醇回流提取1-2次,沙棘黄酮含量较低。

(4)由表2中极差R值大小显示,沙棘总黄酮含量RA＞RC＞RD＞RB,各因素作用主次为A＞C＞D＞B,根据各因素水平均值可知,最佳工艺条件为A1B4C4D2;由表4方差分析结果表明,A 、C因素的影响具有显著性意义 (P＜0.05),B、D因素的影响无显著性意义 (P＞0.05)。根据制剂经验,结合生产实际,为了缩短生产周期,合理降低生产成本,最后确定沙棘黄酮最佳提取工艺条件为 A1B3C3D2,即用50%乙醇提取沙棘果粉3次,第一次加药材质量的10倍乙醇量,提取2小时;第二次加药材质量的10倍乙醇量,提取1小时;第三次加药材质量的8倍乙醇量,提取1小时为佳。三批验证实验总黄酮含量为2.80%,结果表明该工艺稳定可行。

(5)山西省是我国沙棘药材的主要产区之一,沁源县是山西省沙棘资源产量最大的县区,并且通过本文研究证明,沁源沙棘总黄酮含量高出 《中国药典》标准,有望在此地区建立沙棘GAP种植基地,更好地开发利用沙棘药材资源,促进沙棘产业化发展。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2005年版一部.北京:化学工业出版社,2005,127-128.

[2] 高锦明,张鞍灵,李芸生等.沙棘黄酮化学研究的进展[J].沙棘,1998,11(2):34-37.

[3] 刘凤云.沙棘总黄酮的药理研究概况[J].中药材,2004,27(2):145-147.

[4] 王大林.正交试验在中成药制备工艺中研究应用的概况[J].中成药,1997,19(11):41-43.