辽宁绒山羊细管冷冻精液制作规程

刘兴伟 辽宁省畜牧科学研究院 110000

赵圆圆 辽宁省信息中心 110000

张文军 韩迪 豆兴堂 李丰田 辽宁省畜牧科学研究院 110000

1 范围

本规程适用于辽宁绒山羊品种，规定了辽宁绒山羊细管冷冻精液的技术要求、制作程序、解冻方法、检验方法、标识、包装、存放、取用和运输及容器清洗方法。

2 规范性引用文件

下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程，然而鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。

GB 5458液氮生物容器GB/T 1.1-1993标准编写的基本规定GB/T 1.2-1996标准出版印刷的规定

3 术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

精子密度：指1m L精液中的精子数。有效精子数：有效精子数=精液量×密度×活力。精子活力：指37℃环境下直线运动精子占总精子数的百分率。

精子顶体完整率：指顶体完整精子占总精子数的百分率。精子畸形率：指畸形精子占总精子数的百分率。精子存活率：指在37℃环境下保存4小时时直线运动精子占总精子数的百分率。

细菌数：取0.20m L解冻后的冻精经培养24小时后出现的细菌菌落数。

4 规格与质量

4.1 剂型

0.25m L细管冻精。

4.2 质量标准

（1）精子活力≥30%。

（2）每剂细管冻精有效精子数≥1500万个。

（3）精子畸形率≤20%。

（4）精子顶体完整率≥50%。

（5）细菌数≤1000个。

（6）解冻后的精子存活时间

在5℃-8℃条件下保持30%活力的时间≥12小时，在37℃条件下保持30%活力的时间≥4.5小时。

（7）细管冻精标识

在冻精细管上应打印有生产场家、品种、羊号、批号和生产日期。

（8）灌装后的细管必须封口严密,在解冻时不能进水,前端有0.8cm的空隙。

5 制作程序

5.1 采精种公羊的标准

用于制作冻精的种公羊，其体型、外貌和生产性能应合乎本品种的种用公羊一等以上标准，体质健壮，无下列传染病：布鲁氏杆菌病、副结核病、口蹄疫和蓝舌病。

5.2 采精方法

应用假阴道法进行采精。

5.3 原精液检查

原精颜色为乳白色或淡黄色,精子密度≥15×107/ml,活力≥60%,畸形率≤10%，可用于制作细管冻精。

5.4 原精液的稀释

（1）器具卫生

所用器具保证清洁、无菌、无消毒剂残留。

（2）稀释保护剂的配制

配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水、卵黄或在保质期的无动物来源的精子细胞膜保护剂，其他药品要符合国家相关行业规定的标准。

5.5 降温平衡

稀释后的精液经1-1.5小时降温到4℃-5℃，然后在此温度下平衡2-4小时。

5.6 冷冻

将平衡后的细管精液移至－95℃±5℃环境,冷冻3分钟,然后浸入液氮中。

6 解冻方法

将液氮中的细管冻精取出,立即浸没于38℃-40℃的温水中,轻轻摆动约20秒钟取出,用干净纱布擦干。

7 解冻后的检查方法

检查细管冻精的质量时,每只种羊的细管冻精抽检1-2剂。解冻检测合格的细管冻精入库后,每半年进行一次检查。

7.1 解冻活力检查

选择细管冻精上、中、下三个部位的精液在显微镜下观察3-5个视野，应用目测法统计出视野中呈直线运动的精子占总精子数的比例,估算出解冻后的平均活力。

7.2 有效精子数测定

用分光光度仪、红细胞计数器或精子密度检测仪测得原精液的精子密度,根据稀释倍数和解冻后活力,推算出每剂细管冻精的有效精子数。

7.3 顶体完整率和畸形率测定

用姬姆萨染色法或1000倍的带光栅的相差显微镜观测细管冻精的顶体完整率和畸形率，每个样品观察精子总数≥500个。

7.4 解冻后存活时间测定

取同一批次的细管冻精10剂,解冻后浸入37℃的温水中,先测定第1剂细管冻精的活力,然后每隔0.5小时,观测第2剂细管冻精的活力,依此类推,直到水中的细管冻精的精子全部死亡或活力降到30%为止,由此计算出至精子全部死亡时的存活时间和解冻活力降至30%时的存活时间。

7.5 细菌数检查

取0.20m L解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24小时，统计出现的菌落数。

8 包装

采用指形管包装。

9 细管冻精的保存和取用

9.1 保存

贮存于装有液氮的生物容器内,并定期添加液氮,使细管冻精始终浸没于液氮中。在每个包装袋上注明种羊羊号、解冻后活力和数量，不得将不同品种的绒山羊细管冻精混装于同一个冻精袋中或同一个指形管中。

9.2 取用

在取细管冻精时,将冻精袋提升到液氮罐颈口下约10cm处,用长镊子迅速将细管冻精取出进行解冻,操作时间≤10秒钟,如想继续取出细管冻精,则将冻精包装袋浸入液氮中,再重复以上操作,取出的细管冻精停留在空气中的时间≤5秒钟。

10 容器清洗

液氮生物容器应在使用前后彻底检查和清洗。清理时先用中性洗涤剂刷洗，再用40℃-45℃温水冲洗干净，在室温下放置48小时以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器应定期清洗。

11 运输

必须使用超低温生物运输容器进行运输。

（略）