60Coγ照射加深低温保存对大鼠同种带瓣主肺动脉免疫原性的作用

袁茂昆,黄永高,徐克劲

(泰州市人民医院心脏外科,江苏泰州 225300)

60Coγ照射加深低温保存对大鼠同种带瓣主肺动脉免疫原性的作用

袁茂昆,黄永高,徐克劲

(泰州市人民医院心脏外科,江苏泰州 225300)

目的本实验应用60Co γ射线照射加液氮深低温保存大鼠同种带瓣主肺动脉(Valved pulmonary homograft conduit,VPHC),并建立大鼠VPHC颈总动脉移植模型,观察不同照射剂量对同种带瓣主肺动脉免疫原性的作用,寻找合适照射剂量,为进一步基础研究及临床应用提供理论依据。方法1月龄雌性Wistar大鼠50只,作为供体,成年雄性SD大鼠50只,作为受体,随机分为实验对照组(单纯深低温保存组)、300Gy照射组、600 Gy照射组、900 Gy照射组和 1 200 Gy照射组,另取10只SD大鼠行颈总动脉切断吻合术,作为空白对照组。应用流式细胞术对VPHC移植术后1周、2周、3周受体鼠外周血行T细胞及T细胞检测。结果600 Gy照射组VPHC移植术后1周、2周、3周T细胞、T细胞百分率及/与空白对照组相比无显著性差异(P＞0.05),与实验对照组相比差异显著(P＜0.01)。结论应用600Gy60Coγ射线对VPHC进行照射在保持VPHC活性的同时明显降低了其免疫原性。

γ射线;深低温保存;同种带瓣主肺动脉;免疫原性

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0039)

有活性的同种带瓣管道(Valved homograft conduit,VHC)的耐久性优于其它生物材料,但其远期钙化仍是一大难题。据报道其远期钙化与VHC移植术后受体慢性排异反应有直接、重要的关系[1,2]。因VHC为弱免疫原性组织[3,4],移植术后主要表现为慢性排斥反应,故对应用免疫抑制药物和抗CD3、CD4、CD8、CD28和抗细胞因子(IL-2、TNF)及受体(IL-2R)分子的单克隆抗体(mAb)存在很大争议[5,6]。射线照射一方面可以造成组织损伤,另一方面恰当地利用照射在不严重损伤组织活性的条件下通过改变蛋白的空间构象,减少抗原的表达,可望成为一种很有前景的降低移植物免疫原性,进而降低移植术后受体慢性排异反应的有效方法[7,8]。Yokomise等[9]采用60Coγ射线对犬气管进行照射以减轻其免疫原性,发现经1 000Gy照射加深低温保存后移植生存状况优于500 Gy和800Gy的照射剂量,且照射后其组织学仅显示轻度充血,纤毛上皮及腺体组织未见破坏性改变。本实验应用60Coγ射线照射及液氮深低温保存大鼠同种带瓣主肺动脉,并建立大鼠同种带瓣主肺动脉颈总动脉移植模型,观察不同照射剂量对受体鼠外周血及其比值的变化,寻找合适照射剂量,为进一步基础研究及临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器

①XTS-4A手术显微镜(镇江光学仪器厂);

②ELITE流式细胞仪(COULTER公司,美国)。

1.2 主要实验试剂

抗大鼠T细胞亚群单克隆抗体CD系列试剂盒,包括CD4(T辅助/诱导淋巴细胞)、CD8(T抑制/杀伤淋巴细胞)(深圳晶美生物公司)。

1.3 实验动物及分组

一月龄封闭群Wistar大鼠(吉林大学实验动物部提供)50只,雌雄不拘,体重80-100克,作为供体鼠,随机分为5组(n=10),分别为对照组(单纯深低温保存组)、A组(300 Gy照射组)、B组(600Gy照射组)、C组(900 Gy照射组)和D组(1 200 Gy照射组)。成年SD大鼠(中国军事医学科学院实验动物部提供)50只,雄性,体重450-500克,作为受体鼠,随机分为5组(n=10)。另取10只SD大鼠行颈总动脉切断吻合术,作为空白对照组(n=10)。

1.4 大鼠VPHC移植模型的建立

参照张晶等[10]的方法。受体鼠应用3%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔内注射麻醉,仰卧位固定于手术台板上,颈部剃毛后碘伏消毒。自胸骨上缘至下颌骨下方作颈部正中切口,游离右颈总动脉,经无名静脉注入肝素2 mg/kg,然后分别在右颈总动脉近端和远端上血管夹,间隔约10 mm,从中间切断,取制备好的VPHC,在台式手术显微镜下吻合,均采用等弧度吻合法,所用缝线为9/0无创线。吻合完成后,先去除远端血管夹,让血管充盈排气并观察有无出血。如有明显漏血,则需重新上血管夹,加针缝合。如仅为少量渗血,压迫3-5 min即可止住。间置的VPHC均通畅,止血后切口间断缝合。

1.5 流式细胞术(Flow cytometry,FCM)

本研究采用美国COULTER公司生产的ELITE流式细胞仪,激光光源为15MW氩离子激光,波长480 nm,用Multi cycle软件分析处理数据。

应用FCM 检测CD4、CD8细胞亚群工作流程为:①100 μ l EDTA-2Na抗凝血加入 CD4或CD8mAb 20 μ l,混匀后室温下避光30 min;②加入10 ml溶血剂,混匀后避光下作用10 min,离心1 000转/min,弃上清;③沉淀物加入 PBS液,离心 1 500转/min,弃上清;④沉淀物加入0.6 ml PBS液,待上机检测。

1.6 统计学方法

实验结果用SPSS软件包(9.0版)进行统计学处理,所得数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用t检验。

2 结果

表1 VPHC移植术后受体鼠外周血T细胞百分率(±s,n=10)

表1 VPHC移植术后受体鼠外周血T细胞百分率(±s,n=10)

注:*与空白对照组相比 P＜0.05,#与实验对照组相比 P＜0.05

组别 术后1周 术后2周 术后3周空白对照组 37.60±3.65 42.40±5.06 33.60±3.40实验对照组 48.50±4.22 56.50±6.05 57.50±6.11 A 组(300 Gy) 46.60±4.50* 52.20±6.32* 45.10±5.17*#B组(600 Gy) 43.70±4.44*#50.60±5.58*#42.50±4.85*#C组(900 Gy) 40.10±5.12# 48.30±5.62*#38.80±2.97*#D组(1 200 Gy) 38.30±4.48# 45.40±5.14# 35.60±3.09#

表2 移植术后受体鼠外周血结果(±s,n=10)

表2 移植术后受体鼠外周血结果(±s,n=10)

注:*与空白对照组相比 P＜0.05,#与实验对照组相比 P＜0.05

组别 术后1周 术后2周 术后3周空白对照组 37.30±4.32 40.50±5.12 41.80±4.56实验对照组 26.40±3.56 29.20±3.66 35.70±4.32 A 组(300 Gy) 31.20±3.74* 35.70±4.13*#38.60±4.55*B组(600 Gy) 35.10±4.10# 37.90±4.88# 40.40±4.09#C组(900 Gy) 33.80±4.26*#36.50±3.98# 41.20±4.12#D组(1 200 Gy) 32.50±3.77*#35.40±3.78*#33.30±4.66*

表3 移植术后受体鼠外周血/CD8+结果(±s,n=10)

表3 移植术后受体鼠外周血/CD8+结果(±s,n=10)

注:*与空白对照组相比 P＜0.01,#与实验对照组相比 P＜0.01

组别 术后1周 术后2周 术后3周空白对照 1.01±0.23 1.05±0.25 0.80±0.22实验对照 1.84±0.32 1.93±0.35 1.61±0.26 A 组(300 Gy) 1.43±0.19*#1.45±0.28*#1.17±0.20*#B组(600 Gy) 1.25±0.20*#1.34±0.22*#1.05±0.18*#C组(900 Gy) 1.19±0.16*#1.32±0.18*#0.94±0.14*#D组(1 200 Gy) 1.18±0.17*#1.29±1.20*#1.07±0.17*#

3 讨论

同种带瓣管道植入后的退行性变与免疫排斥的关系越来越为人们所关注。近年来许多作者的实验都有力地证实,同种带瓣管道移植后出现免疫排斥反应[11,12]。多数学者认为,同种带瓣管道的退行性变与免疫有直接、重要的关系[13,14]。在同种异体器官移植的研究中普遍认为细胞介导的移植排斥反应是由于移植物HLAⅡ类抗原刺激受体T细胞,使其激活、增殖、分化并分泌许多细胞因子[15]。临床研究证明,VHC移植术后激发宿主产生免疫反应,外来抗原激活宿主T淋巴细胞使其增殖、分化,并产生IL-2和干扰素(IFN)γ等细胞因子而激活的CD8+T淋巴细胞积聚于移植物局部对移植物具有杀伤性作用,使得T淋巴细胞在血中所占比例减少,CD4+/CD8+比值增高[16]。因而通过检测受体血CD4+和CD8+及二者比值的动态变化对判断VHC移植术后排斥反应的强度有重要意义。本研究结果显示,随着照射剂量的增加外周血T淋巴细胞百分率明显减少,B、C、D组与实验对照组相比有显著性差异(P＜0.05);而外周血T淋巴细胞百分率明显增加,A、B、C、D组与实验对照组相比均有显著性差异(P＜0.05);/比值A、B、C、D组与实验对照组相比均有显著性差异(P＜0.01)。可见60Coγ照射可能通过减弱MHC抗原的表达,抑制宿主T淋巴细胞增殖、分化和产生IL-2、IFN-γ等细胞因子,有效地降低VPHC移植术后宿主产生免疫排斥反应,随着照射剂量的增加,同种带瓣主肺动脉抗原表达量减少,因而受体鼠外周血CD4+T淋巴细胞百分率逐渐减少,而外周血T淋巴细胞百分率逐渐增加。结合我们前期实验结果[17],可以推断600 Gy60Coγ照射在不严重损伤VPHC活性的同时明显地降低了VPHC移植术后免疫排斥反应的发生,可作为参考剂量用于降低VPHC免疫原性的研究。

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Immunogenicity in Rat Conduit Pulmonary Valved Homograft with60Co Gamma Irradiation and Cryopreservation

YUAN Mao-kun,HUANG Yong-gao,XU Ke-jin.(Department of Cardiac Surgery,Taizhou Peoples Hospital,Jiangsu,Taizhou063000,China)

ObjectiveTo determine the suitable dosage of60Co γray to be used prior to cryopreservationin order to reduce the immunogenicity of CPVH.Methodsfifty one-month old female Wistar ratswere used as donors andwere divided into five groups(n=10).Fifty SD adult ratswere used as recipients andwere divided into five groups respectively(n=10).Four experimental groups were irradiatedwith60Coγray of different dosages prior to cryopreservation;300 Gy group,600 Gy group,900 Gy group,1 200 Gy group.The experimental control group

cryopreservation only.And tenSD rats underwent right carotid artery end-to-end anastomosiswere used as a control group.Flow Cytometry was used to test,T-cells in peripheral blood of recipient rats at weekly interval of 1,2,3 weeks postoperatively.ResultsThere was no significant difference between 600 Gy group and the control group in percentages of,T-cells.ConclusionThe dosage of 600 Gy60Coγray irradiation prior to cryopreservation would be the optimal dosage for reducing immunogenicity of the VPHC in rats.

γray;Cryopreservation;Valved pulmonary homograft conduit;Immunogenicity

R543;R815.5

A

1007-4287(2010)01-0039-03

袁茂昆(1965-),男,博士,科主任,主任医师,研究方向:同种带瓣管道。

2009-06-19)