曼氏裂头蚴感染小鼠血清IgG抗体动态变化*

李 楠,崔 晶,王书伟,李旭旭,王 莉,姜 鹏,蔺西萌,王中全

2.河南省疾病预防控制中心,郑州 450016

曼氏裂头蚴感染小鼠血清IgG抗体动态变化*

李 楠1,崔 晶1,王书伟1,李旭旭1,王 莉1,姜 鹏1,蔺西萌2,王中全1

目的观察小鼠实验感染曼氏裂头蚴后不同时间血清IgG抗体水平的变化。方法40只小鼠随机分为5组,每组8只,1-5组小鼠采集尾静脉血后分别经口感染裂头蚴1、2、4、6及8条。感染后1周开始每周尾静脉采血,分离血清,至感染后18周。应用裂头蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原ELISA检测血清中抗裂头蚴IgG抗体水平。结果2条裂头蚴感染小鼠感染后2周的血清抗体阳性率为87.5%(7/8),感染后3周升至100%(8/8);1、4、6及8条裂头蚴感染小鼠感染后2周抗体阳性率即达100%(8/8)。5组小鼠均是在感染2～4周后血清抗体水平快速升高,感染后5～7周达峰值,之后抗体水平稍有下降,至感染后第18周抗体阳性率仍均为100%。5组小鼠感染裂头蚴后1～18周血清抗体水平间的差异有统计学意义(F=245.296,P＜0.05),且抗体水平随感染剂量的增加而升高。结论小鼠感染不同剂量裂头蚴后2周即可检出血清抗裂头蚴抗体,ES抗原ELISA对不同感染度小鼠均有早期诊断价值。

裂头蚴;裂头蚴病;ELISA;排泄分泌抗原;小鼠

曼氏裂头蚴病(sparganosis mansoni)是由曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)的幼虫-裂头蚴(plerocercoid)寄生人体所致的人兽共患寄生虫病。本病呈世界性分布,但以东亚与东南亚国家多见,我国已有1 000多例裂头蚴病报道,分布于27个省、市、自治区〔1〕。裂头蚴可经口感染人体,也可经皮肤伤口或口腔黏膜侵入人体,寄生于皮下、眼、口腔、脑及多个内脏器官等。由于裂头蚴的寄生部位广泛,临床表现多种多样,皮肤裂头蚴病的诊断主要依靠活检,但多数脑部及内脏裂头蚴病只有1条裂头蚴寄生〔2〕,手术风险大,病原学诊断较为困难,若不及时诊断和治疗,可致患者残疾甚至死亡。

目前,国内外已有将裂头蚴可溶性抗原通过ELISA用于裂头蚴病的血清学诊断,但与其他寄生虫病(囊虫病、包虫病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病及旋毛虫病等)均有明显的交叉反应〔3-5〕。此外,有人报告小鼠感染5条裂头蚴后第4周血清抗裂头蚴IgG水平才开始快速升高〔6〕,裂头蚴在人体寄生时间较长者血清抗体阴性〔3〕。鉴于此,本文应用裂头蚴排泄分泌(excretory-secretory,ES)抗原ELISA对裂头蚴感染小鼠血清IgG抗体动态进行了观察。

1 材料和方法

1.1 裂头蚴与实验动物 曼氏裂头蚴采自河南省漯河地区自然感染的青蛙体内,选取伸缩活动剧烈的裂头蚴,用无菌生理盐水清洗3次后经口感染小鼠及用于抗原制备。健康雄性6周龄昆明小鼠,体重20g～25g,购自郑州大学医学院实验动物中心。1.2 裂头蚴ES抗原的制备 参照旋毛虫肌幼虫ES抗原的制备方法〔7〕,将裂头蚴用无菌生理盐水清洗3次后置于无血清的1640培养液(含100U/mL青霉素及100U/mL链霉素)中,每个培养皿中加入20mL培养液与10条裂头蚴。在5%CO2培养箱中37℃培养18h,培养过程中保证虫体完整无断裂。将培养液于4℃2 000 g离心20 min,取上清装入透析袋中,4℃用去离子水透析3 d。冷冻干燥浓缩至一定体积即为ES抗原。考马斯亮蓝法测抗原蛋白含量为2.755mg/mL,分装后置-80℃冰箱备用。

1.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)按常规间接ELISA法操作,用碳酸盐缓冲液将ES抗原稀释至2.5μ g/ml包被酶标板,封闭液为含3%脱脂奶粉的PBST。待检血清用封闭液1∶100稀释,每份样本加2孔,每孔100 μ L。辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG,工作浓度1∶10 000(北京中杉金桥生物制品公司)。底物为邻苯二胺(OPD)。2mol/L H2SO4终止反应后用酶标仪(美国TECAN公司产品)测定吸光值(A492nm)。当待测样本两孔A值的平均值≧阴性对照A值2.1倍时为阳性。

1.4 裂头蚴感染小鼠后血清样本的采集 40只昆明小鼠随机分为5组,每组8只。1～5组小鼠每只分别经口感染1、2、4、6、8 条裂头蚴,感染前与感染后1～18周每周尾静脉采血。所有实验小鼠于感染后第18周解剖,计数检获的裂头蚴。

1.5 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行描述性分析,实验数据用均数±标准差表示,应用方差分析与多个独立样本非参数检验对数据进行统计学分析,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 感染小鼠血清抗体IgG动态 各组小鼠感染裂头蚴前后不同时间血清抗体IgG水平变化见图1。感染前各组小鼠血清抗体IgG均为阴性。感染后第1周,第5组小鼠血清抗体阳性率为37.5%(3/8),第1-4组小鼠血清抗体均为阴性;感染后第2周,第2组小鼠抗体阳性率为87.5%(7/8),其各组小鼠抗体阳性率均为100(8/8);感染后第3周,所有感染组小鼠阳性率均为100%(8/8)。所有感染组小鼠均在感染后2～4周血清抗体快速升高,第5～7周达峰值。经非参数检验各组小鼠感染后1～7周血清抗体水平间的差异均具有统计学意义(χ21=48.096,χ22=48.584,χ24=51.623,χ26=45.940,χ28=48.940,P均＜0.05);感染1条或2条裂头蚴组小鼠的血清抗体水平在感染后7～18周无明显降低(F1=0.513,F2=0.663,P＞0.05),感染 4、6、8 条裂头蚴组小鼠在感染后7～18周的血清抗体水平有所降低(F4=6.590,F6=7.371,F8=5.555,P均＜0.05),但至实验结束时的感染后18周仍均为阳性。

图1 小鼠感染不同剂量曼氏裂头蚴后的血清IgG抗体水平变化Fig.1 Anti-plerocercoid antibody dynamics in sera of mice infected with different dose of plerocercoids

2.2 感染虫数与血清抗体水平的关系 感染小鼠于感染后18周解剖,检出的裂头蚴数与感染数相等。经方差分析,感染后1～18周,不同感染组小鼠之间的血清抗体水平的差异有统计学意义(F=245.296,P＜0.05);进一步两两比较,除第1组和第2组小鼠组间的抗体水平的差异无统计学意义,其余3组小鼠间的抗体水平的差异有统计学意义。5组小鼠血清抗体水平与裂头蚴感染剂量有相关性(r=0.323,P＜0.05),且小鼠感染裂头蚴后的血清抗体水平均随感染剂量的增加而升高。

3 讨 论

Hong等〔6〕应用裂头蚴粗抗原ELISA检测小鼠感染5条裂头蚴后血清IgG抗体动态,发现感染后第4周抗体水平快速升高。本研究以裂头蚴ES抗原ELISA检测IgG抗体动态,发现感染1周后抗体即快速升高,至感染后第3周,所有感染组小鼠的抗体均为阳性。提示裂头蚴 ES抗原检测IgG抗体,具有早期诊断价值,可能与裂头蚴感染宿主后在体内移行发育的过程中其ES抗原直接暴露于宿主的免疫系统有关,Chung等〔8〕应用 immunoblot检测裂头蚴粗抗原,发现粗抗原中的36kDa～26kDa组分与感染后第2周小鼠血清IgG呈阳性反应;27、31、36kDa蛋白是裂头蚴ES抗原中的主要蛋白组分,且具有半胱氨酸酶活性〔9-10〕。上述结果表明,与裂头蚴粗抗原相比,ES抗原具有更强的抗原性,其主要抗原分子能较早诱导产生特异性IgG,可用于裂头蚴病的早期诊断。

本研究结果还发现,小鼠感染1条裂头蚴后2周血清抗体阳性率即达100%,血清抗体水平随裂头蚴感染条数的增加而升高。王越等〔5〕应用裂头蚴粗抗原ELISA检测1～5条裂头蚴感染小鼠7周后的血清抗体,发现1条裂头蚴感染小鼠的血清抗体亦为阳性,但不同剂量感染组小鼠之间的血清中抗体水平差异无统计学意义。裂头蚴ES抗原检测结果不同,提示小鼠血清抗裂头蚴抗体水平与感染剂量呈正相关。裂头蚴ES抗原ELISA不仅可用于裂头蚴轻度感染的血清学诊断,而且还能根据抗体水平推测感染程度。

〔1〕裘明华,裘明德.人裂头蚴病和无头蚴病:Ⅰ.病原学的过去和现在〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2009,27(1):54-60.

〔2〕王越,干小仙.曼氏裂头蚴病诊断研究进展〔J〕.中国人兽共患病学报,2007,23(9):942-944.

〔3〕Kim H,Kim SI,Cho SY.Serological diagnosis of human sparganosis by means of micro-ELISA〔J〕.Korean J Parasit,1984,22(2):222-228.

〔4〕Nishiyama T,Ide T,Himes SR Jr,et al.Immunodiagnosis of human sparganosis mansoni by micro-chemiluminescence enzymelinked immunosorbent assay〔J〕.T rans R Soc T rop Med Hyg,1994,88(6):663-665.

〔5〕王越,叶丽萍,孙亚维,等.曼氏裂头蚴可溶性抗原DIGFA法快速检测特异性抗体的潜在诊断价值〔J〕.中国病原生物学杂志,2006,1(4):260-262.

〔6〕Hong ST,Kim KJ,Huh S,et al.The changes of histopathology and serum anti-sparganum IgG in experimental sparganosis of mice〔J〕.Korean J Parasitol,1989,27(4):261-269.

〔7〕崔晶,王中全,张灯.旋毛虫肌幼虫排泄分泌物中特异性诊断抗原的研究〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2003,21(5):268-271.

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〔9〕Cho SY,Chung YB,Kong Y.Component proteins and protease activities in excretory-secretory product of sparganum〔J〕.Korean J Parasitol,1992,30(3):227-230.

〔10〕Kong Y,Chung YB,Cho SY,et al.Cleavage of immunoglobulin G by excretory-secretory cathepsin S-like protease ofSpirometra mansoniplerocercoid〔J〕.Parasitology,1994,109(Pt 5):611-621.

Kinetics of specific IgG in sera of mice infected experimentally with plerocercoid ofSpirometra mansoni

LI Nan,CUI Jing,WANG Shu-wei,LI Xu-xu,WANG Li,JIANG Peng,LIN Xi-meng,WANG Zhong-quan
(Departmentof Parasitology,Medical College,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

To observe the changes of serum IgG levels in mice experimentally infected with plerocercoid ofSpirometra mansoni,40 male mice were randomly divided into 5 groups(8 mice per group)and each mouse inⅠtoⅤgroups was orally infected with 1,2,4,6 or 8 plerocercoids respectively after blood collection.Blood was collected weekly for 18 weeks post-infection(wpi)and the anti-plerocercoid antibodies IgG in serum were assayed by ELISA using excretory-secretory(ES)antigens ofSpirometramansoniplerocercoid.The serum antibodies positive rate of mice infected with 2 plerocercoids was 87.5%(7/8)at 2 wpi and increased to 100%(8/8)at 3 wpi.However,in other four groups of mice infected with 1,4,6 and 8 plerocercoids,the antibody positive rate was 100%(8/8)at 2 wpi.The serum anti-plerocercoid antibody levels in the 5 groups of infected mice increased rapidly at 2 to 4 wpi,and reached the peak during 5 to 7 wpi.Thereafter,the antibody level in the 5 groups decreased slightly,but the antibody positive rate was still 100%and lasted to 18 wpi as the experiment was finished.The difference of serum antibody levels during 1 to 18 wpi in the 5 groups was statistically significant(F=245.296,P＜0.05),and the serum antibody levels elevated along with the increase of infection dose.Results showed that serum anti-plerocercoid antibodies in mice infected with different doses of plerocercoid could be detected at 2 wpi,and ES antigens ELISA ofSpirometramansoniplerocercoid could be applied in the diagnosis of early sparganosis and light infection.

plerocercoid;sparganosis;ELISA;excretory-secretory(ES)antigens;mice

R383.3

A

1002-2694(2010)09-0837-03

*河南省医学科技攻关(200903151,201003006)、河南省教育厅科技攻关(2010A310012)及郑州大学研究生科学研究基金(D0403)资助项目

崔晶,Email:cuij@zzu.edu.cn

1.郑州大学医学院寄生虫学教研室,郑州 450052;

2.河南省疾病预防控制中心,郑州 450016

2010-03-18;

2010-06-19