铜陵矿集区土壤中污染元素对微生物特性的影响研究

刘丽，李湘凌，范丽，王成慧，杨善谋，袁峰，周涛发

合肥工业大学资源与环境工程学院，安徽 合肥230009

在土壤污染方面，为了防止土壤质量退化，实现土壤资源的持续利用，对土壤质量的评估和预测显得越来越重要。土壤微生物是土壤生态系统的基本组分，土壤微生物对土壤中的动植物残体和土壤有机质及其有害物质的分解、生物化学循环和土壤结构的形成过程起着重要的调节作用[1-2]。污染元素在土壤中不断累积必然会破坏土壤固有微生物群落结构及其活性，减弱土壤微生物的作用，最终使得土壤肥力和质量降低[3]。因此，土壤微生物群落结构特征和微生物活性状况可反映出污染元素的污染程度[4]。

污染元素作为最严重的土壤污染物之一，可对土壤微生物产生较大的影响，而土壤微生物能够在种群、生理生化、遗传等对重金属胁迫做出响应以适应元素污染环境[5]。近年来，由于重金属等污染元素污染毒害作用越来越威胁着人类的生存环境和身体健康，对其研究日益增多，尤其是在生物修复方面已经成为研究重点[6]。采用传统的淋滤法、客土法等物理化学方法修复重金属污染土壤是非常困难和昂贵的，生物修复法能克服传统方法中的缺点，越来越受到重视。研究土壤微生物对元素污染响应的方式及其机理，对元素污染土壤的生物评价和生物修复等方面具有指导意义[7]。污染元素随着污水进人土壤后，一方面，它的迁移转化受到土壤理化性质的溶解和固定作用，另一方面又受到微生物的溶解、吸收和富集作用，同时对微生物的生长、代谢产生影响[8-10]。本文通过铜陵矿集区土壤中重金属及非金属污染元素含量与土壤中微生物生物量之间的对应关系，研究其环境效应，土壤中的微生物种类繁多，有的可作为环境载体吸持重金属等污染物，可从中提取一些耐重金属的微生物，为土壤生物修复提供优势菌种，以期达到土壤重金属污染修复的目的。

1 研究区概况

铜陵矿集区位于长江中下游铁铜金多金属成矿带的中部。矿集区的矿业活动已引起了诸多的环境负效应，包括冶炼渣堆、废石堆、尾矿砂和岩矿体等的自然风化，酸性矿山排水的产生和重金属的释放，矿区水系及其沉积物潜在生态危害、土壤污染以及生物损害、大气变化等。已有研究显示，铜陵矿集区表层土壤中的Zn、Cu、Cd、Pb等重金属元素含量大部分超标[11-13]。

2 材料和方法

2.1 样品采集

土壤样品的采集采用网格采样法，约每隔4 km取一样品，如图 1所示，在铜陵矿集区共采集 48个样品。用铁铲采集深度为20 cm的土样约20 g装入无菌牛皮袋中，封好袋口，另取一部分土壤约100 g于采样袋中，并记录取样地点及环境特征和详细日期。取回土样后，将一部分新鲜土壤置于0 ℃～4 ℃保存供测试土壤微生物用；另一部分土壤风干后用来测定土壤基本理化性质和元素含量。

图1 铜陵地区采样分布图Fig.1 Sampling distribution of Tongling area

2.2 土壤中微生物的分离与计数

2.2.1 微生物培养基的制备

分别配制三种不同的培养基，以用于分离土壤中的细菌、放线菌、高铁还原菌。三种培养基的配制为[14]：①细菌：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，pH7.0；②放线菌（高氏一号培养基）：可溶性淀粉 20 g、氯化钠0.5 g、硝酸钾1 g、磷酸氢二钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，pH7.4~7.6；③高铁还原菌：蔗糖5 g、磷酸氢二钾0.5 g、硫酸镁0.2 g、硫酸铵1.0 g、碳酸钙5 g、氢氧化铁0.5 g、酵母粉0.15 g、蒸馏水1000 mL。这些培养基均在0.1 Mpa下灭菌20 min。

2.2.2 微生物的分离与计数

细菌和放线菌采用稀释平板涂布法计数，高铁还原菌采用最大或然数法计数。首先进行土壤悬液的制备，准确称取10 g土壤，放入装有90 mL无菌水的250 mL锥形瓶中，振荡10 min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，再依次用无菌试管稀释溶液至所需要的梯度。细菌稀释浓度一般是10-4~10-6，放线菌为 10-3~10-5，用无菌移液管吸取0.1 mL接种到含有20 mL培养基的培养皿正中间，用涂布棒涂布均匀。每个浓度梯度分别做三个重复。接种后的培养皿倒置于 28 ℃~30 ℃恒温箱中培养。细菌培养1 d，放线菌培养5~7 d。然后取出，选取细菌和放线菌出现菌落数在 30~300之间的培养皿进行计数，然后折算出每1 g干土中的菌数。

高铁还原菌是用稀释梯度为10-1~10-6的土壤悬浮液接种，每管装培养液20 mL，接种1 mL，每个稀释梯度重复四次。28 ℃~30℃深层培养7~10 d，用1%2，a-联吡啶的10%醋酸溶液（按体积比配制）测定，如有亚铁存在，则成红色反应。由反应情况得出数量指标，再对照最大或然数表得出最终结果。

2.3 土样中元素含量的测定

采集的土壤样品在室内风干约50 g，过20目筛并充分混匀后，送国土资源部合肥矿产资源监督检测中心测试。As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量采用日本理学ZSX100e型X射线荧光光谱仪测得。

3 结果与讨论

铜陵矿集区土壤中As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量与土壤中细菌、放线菌、高铁还原菌数量之间的对应关系如图2~7所示。可见，土壤污染元素在低浓度条件下对土壤中微生物的数量有一定刺激增长作用，但高浓度则会对微生物的数量起抑制作用；同时，由于部分微生物受污染元素的胁迫而产生了耐受性，因此在一些污染元素含量高的区域微生物含量也高。具体的相关关系为，As、Au、Zn、Cu与细菌和放线菌，Cd、Pb与放线菌的含量呈负相关关系，指示了土壤中高浓度污染元素对微生物的抑制作用；Cd、Pb与细菌，Cd、Zn与高铁还原菌的含量呈正相关关系，反映部分微生物受污染元素的胁迫已产生了耐受性；Au、Pb、As与高铁还原菌数量的关系不明显。不同类群的微生物对污染元素的敏感程度不同，在本实验中，三种菌种的敏感程度依次是：放线菌>细菌>高铁还原菌。

微生物在自然界物质的分解、转化和循环中起重要作用，在其生长代谢和分化过程中，除了 K、Na、Ca、Mg外，还需要有一些具有特殊生物学功能的微量金属元素[15]，如Cu是多酚氧化酶的组分并为羧化酶作用所必需。但是当环境中的元素尤其是重金属元素浓度增高到一定程度时，就会影响甚至抑制微生物的生长及代谢活动[16]。Cd对细胞具有致突变效应，导致DNA链断裂，Cd还可与含羧基、氨基，特别是含琉基的蛋白质分子结合，而使许多酶的活性受到抑制和破坏，使肾、肝等组织中的酶系功能受到损害[17]。Pb可与微生物体内一系列蛋白质、酶和氨基酸内的功能团相结合，从多方面干扰机体的生化和生理功能，可造成细胞膜的损伤，破坏营养物质的运输。同时，在高浓度下，重金属离子可在胞内形成非专一性的复杂化合物而产生毒性作用[18]。本文的土样来自于铜陵矿集区，其重金属等污染元素含量已明显高于土壤背景值，土壤元素污染较严重，因此，生长在其中的微生物已受到污染元素胁迫的影响，如As、Au、Zn、Cu对细菌以及As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb对放线菌的胁迫，均导致了微生物数量的降低，通过实验数据发现，微生物在重金属含量高的区域和含量低的区域的数量下降了大约2~3个数量级，有些区域微生物数量下降了约50%，重金属对微生物的影响显著。

图2 As与土壤中微生物数量的对应关系Fig.2 The correspondence of As and the number of microorganisms in the soil

图3 Au与土壤中微生物数量的对应关系Fig.3 The correspondence of Au and the number of microorganisms in the soil

图4 Cd与土壤中微生物数量的对应关系Fig.4 The correspondence of Cd and the number of microorganisms in the soil

图5 Zn与土壤中微生物数量的对应关系Fig.5 The correspondence of Zn and the number of microorganisms in the soil

低浓度的重金属等元素刺激微生物的生长，而高浓度则抑制微生物的生长，一般是基于重金属与微生物之间的相互作用。段学军[19]在重金属影响微生物数量及群落结构多样性方面进行了研究，通过模拟试验，得到了重金属元素对微生物的毒性效应与其浓度的关系，二者一般呈负相关关系，其相关显著性与重金属种类、土壤类型及微生物类群有关。Garland[20]、Tucker et al[21]研究发现，土壤中重金属含量超过一定浓度时，对微生物有着明显的毒害作用，能引起蛋白质变性及改变生物膜透性，土壤微生物的生长、繁殖和代谢均受到干扰，这不仅使得微生物生物量下降，碳氮比亦发生变化，还影响到有机质的微生物转化效率[22]，导致微生物群落结构发生变化，种群减少、生态平衡稳定性受到破坏。Brookes et al[23]采用土壤熏蒸法测定了使用含重金属的污泥达 20年的农业土壤中微生物的总量，认为重金属对土壤微生物总量有抑制作用，低浓度的重金属元素对微生物生物量没有大的影响，而高浓度的 Cu、Zn使生物量下降 40%。杨元根等[22]研究对比了农村土壤和城市土壤中重金属含量对微生物特征的影响，发现含高浓度重金属的城市土壤中，微生物的生物量显著降低。在铜陵矿集区，随着土壤中污染元素如As、Au、Zn、Cu浓度的升高，细菌的数量随之下降，而As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb的浓度升高会导致放线菌数量的下降。因此，微生物的生物量是对土壤中重金属等元素污染的敏感指标之一，当然，已有研究还提出了微生物活性、微生物商和代谢商变化等指标[24]，对于铜陵矿集区而言，建立相关微生物土壤质量评价指标的研究还有待进一步的开展。

图6 Cu与土壤中微生物数量的对应关系Fig.6 The correspondence of Cu and the number of microorganisms in the soil

图7 Pb与土壤中微生物数量的对应关系Fig.7 The correspondence of Pb and the number of microorganisms in the soil

同时也存在另一种情况，由于微生物对重金属等污染元素存在一定的耐受性或由于受胁迫而产生了耐受性，微生物数量和污染元素含量之间也会存在一定的正相关性。在铜陵矿集区，Cd含量与细菌、高铁还原菌数量（图 4），Zn含量与高铁还原菌数量（图5），Pb含量与细菌数量（图7），均表现出了一定的正相关关系。由实验所得数据可以看出在重金属含量高的区域，微生物的数量并没有减少，相反其数量随着重金属含量的增高而增多, 在Cd、Zn、Pb含量高的区域微生物含量较重金属含量低的高约一个数量级。Cd、Zn、Pb是世界公认的有害重金属物质[25]，本文研究显示，铜陵矿集区部分土壤中细菌、高铁还原菌对这三种重金属元素的抗性水平较高，这可能是由于矿集区土壤长期受这些重金属污染，而使其中部分抗性高的微生物菌种取代了敏感菌种，或使部分菌种发生了基因改变、生理适应，并得到繁殖，这些土壤中所含有的大量的耐性菌种，同时也具有作为土壤重金属元素污染修复微生物菌种的潜力[26]，微生物对重金属的抗性和解毒机制，是基于其与重金属之间的一些相互作用，已有研究表明，微生物对重金属的作用主要表现在微生物对重金属的生物积累和生物吸着，包括胞外络合、沉淀及积累；微生物对重金属还有一定的生物转化作用，包括微生物对重金属的生物氧化还原、甲基化与去甲基化以及重金属的溶解和有机络合配位降解转化重金属[27]。微生物与重金属间的作用在工业上已有一些应用，Sharma[28]等于2000年发现，在厌氧环境中加入硫代亚磺酸酯，克氏杆菌可以将Cd2+转化为CdS沉淀，这一过程在镉污染废水的处理中具有重要的意义。

4 结论

（1）铜陵矿集区土壤中As、Au、Cd、Zn、Cu、Pb元素含量与土壤中细菌、放线菌、高铁还原菌数量之间的相关关系为：As、Au、Zn、Cu与细菌和放线菌，Cd、Pb与放线菌的含量呈负相关关系，指示了土壤中高浓度污染元素对微生物的抑制作用；Cd、Pb与细菌，Cd、Zn与高铁还原菌的含量呈正相关关系，反映部分微生物受污染元素的胁迫已产生了耐受性；Au、Pb、As与高铁还原菌数量的关系不明显。

（2）铜陵矿集区土壤中三种菌种对污染元素的敏感程度不同，其敏感程度依次是：放线菌>细菌>高铁还原菌。

（3）铜陵矿集区部分土壤中，细菌、高铁还原菌由于其本身的耐受性或由于受胁迫而产生了耐受性，对Cd、Zn、Pb等三种重金属污染元素的抗性水平较高，具有作为土壤重金属元素污染修复微生物菌种的潜力。

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