冬虫夏草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

谢 放，朱子雄，田 伟，张 楠

（兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070）

冬虫夏草是我国珍稀名贵中药材之一[1]。前人在其分类与遗传多样性方面已经做了许多工作[2-4]。但他们对冬虫夏草遗传多样性的研究，主要依据RAPD、RFLP、ITS 技术，而侧重于虫草 ISSR（Intersimple Sequence Repeats）分子标记的研究尚未见报道。ISSR是由Zietkiewiez等[5]于1994年提出的用于扩增2个距离较近的相邻SSR位点间序列的一种方法，较RFLP便宜，比RAPD重复性高，且ISSR多态性高。此外，它不需要知道被检测物种任何基因组的信息，因此ISSR标记非常适合基因组信息缺乏物种的研究。自该技术发明以来，已被广泛应用于生物的遗传多样性、分子标记及农作物遗传多样性的研究中[6]。本试验旨在明确ISSR-PCR反应中各项参数对试验结果的影响，建立并优化适用于冬虫夏草的ISSR反应体系，为进一步研究冬虫夏草遗传多样性奠定基础。

1 材料与方法

供试物种冬虫夏草分别采自甘肃省虫草主要产地：天祝打柴沟镇东山，甘南合作市合作镇扎油沟和甘肃漳县金钟镇路骨山。菌种由兰州交通大学生物种苗工程研究所分离纯化，获得菌株。

1.1 基因组DNA提取及定量

基因组DNA的提取采用改良的CTAB法[4]：在提取DNA过程中加入10%β-巯基乙醇防止酚类物质被氧化发生褐变；采用Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）、氯仿∶异戊醇（24∶1）和 3 mol/L NaAc 溶液（pH 6.0）作为提取液，加速蛋白的变性过程、盐类物质的沉降以及脂溶性色素的溶解，使获得的DNA溶液颜色明显变浅，显著增加后续提取的DNA的质量。经改良后的方法所提取的基因组DNA都比较理想，符合分子生物学实验的要求。

1.2 DNA的定量

将DNA溶于TE缓冲液 [10 mM Tris-HCl,l mM EDTA（pH 8.0）]中，从中取出 10 μL 用 TE 稀释至2 mL，在紫外分光光度计下测量OD260的值，并根据基因组DNA的浓度值进行计算。最后将样品浓度调至20 ng/μL，于-20℃保存备用，用于ISSR-PCR分析。

1.3 ISSR扩增反应体系及程序

ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，dNTP和TaqDNA聚合酶购于TaKaRa公司。试验以随机选取的835号引物为固定引物，其序列为：AGAGAGAGAGAGAGAGYC。扩增反应在PCR反应薄壁管中进行，利用Biometra公司的梯度PCR仪进行扩增。

25μL反应体系中各反应物含量为：20 ng模板DNA，10 mmol/L dNTP，20 μmol/L ISSR 引物，1 U TaqDNA 聚合酶，10×PCR Buffer，25 mmol/L MgCl2。

ISSR-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性 45 s，49℃（48℃～58℃） 退火 45 s，72℃延伸45 s，共35个循环，72℃延伸10 min，4℃保温。

1.4 PCR检测结果

取5μL PCR扩增产物与1μL 6×加样缓冲液（TaKaRa）混匀，点入含10 mg/mL EB的1.2%琼脂糖凝胶中，于5 V/cm电场强度下电泳1 h，在UVP凝胶成像系统下观察照相。

1.5 ISSR反应条件优化

参考紫花苜蓿[8]、鸭茅[9]、槟榔[10]的 ISSR 扩增程序和反应体系，确定最佳反应条件。对反应体系各因素设置不同梯度水平（表1）。在试验中当对某一因素进行梯度设置时，其余因素均保持不变。在最佳反应体系的基础上在梯度PCR仪上进行退火温度筛选，每个梯度设3个重复，筛选出合适的退火温度。

表1 ISSR反应系统优化设计

2 结果与分析

2.1 DNA检测

经0.8%的琼脂糖电泳、UVP凝胶成像系统下观察检测DNA，所提取的DNA都为一清晰明亮的主带。再通过紫外分光光度计测定OD260的值，通过计算得DNA浓度为50～80 ng/L，DNA质量电泳带无拖尾现象且图像较为清晰（图1），可知所提DNA纯度较高，RNA和蛋白质含量较少，根据计算将DNA浓度调整为20 ng/μL，于-20℃贮存备用。

图1 DNA模板电泳检测图谱

2.2 Mg2+浓度对ISSR的影响

增加Mg2+的浓度可以增加Taq DNA聚合酶的扩增效率，但会降低PCR的特异性。从图2可知当Mg2+浓度低于1.5 mmol/L时扩增产物减少甚至没有；而Mg2+浓度大于1.5 mmol/L时，谱带背景变浓且出现弥散现象，主带不易分辨且小片段谱带数量开始逐渐减少。因此冬虫夏草ISSR-PCR反应中Mg2+最佳浓度为1.5 mmol/L。

图2 不同Mg2+浓度的电泳图谱

2.3 dNTP用量对ISSR的影响

dNTP是ISSR-PCR扩增的原料，其浓度直接影响PCR扩增产物的生成，当PCR反应在Mg2+浓度为1.5 mmol/L时随着dNTP浓度的增大，PCR反应增强，特别是较大片段PCR产物反映更为明显。但随着dNTP浓度的继续增大，PCR反应抑制，扩增条带亮度减弱、条带数减少。由图3可知，dNTP浓度低于0.08 mmol/L时，扩增产物背景模糊且大片段扩增产物出现模糊现象；而高于0.16 mmol/L时，出现明显条带缺失现象。因此冬虫夏草ISSRPCR反应体系中最佳 dNTP浓度为 0.08～0.16 mmol/L。

2.4 Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR的影响

图3 不同dNTP浓度的电泳图谱

在ISSR-PCR反应体系中Taq酶是重要的因子，它的种类、活性与用量关系到扩增反应能否正常进行。由图4可知，当Taq酶用量为0.5 U时，获得了良好的扩增效果；当Taq酶量大于0.5 U时，扩增条带产物减少且开始出现弥散现象。可知随着酶量的增加，PCR扩增效果降低，这与一些文献报道相同[11]。考虑综合成本，本研究在25μL反应体系中选择每个反应0.5 U的酶量作为冬虫夏草ISSR反应的最佳酶用量。

图4 不同酶用量的电泳图谱

2.5 引物浓度对ISSR的影响

引物浓度的高低在PCR反应中也是重要的影响因素。如图5所示：1～18泳道均有扩增产物，但当引物浓度小于0.8μmol/L时，只有两条主带；引物浓度在0.8～1.0μmol/L时，条带最清晰稳定；大于1μmol/L时，扩增产物逐渐减少，谱带不清晰且有弥散现象。故冬虫夏草ISSR-PCR最佳引物浓度以0.8～1.0μmol/L为宜。

图5 不同引物浓度的电泳图谱

2.6 模板DNA用量对ISSR-PCR的影响

良好的模板质量和浓度是保证PCR特异性扩增的前提。由图6可知，模板用量为15～20 ng时，均能产生清晰扩增条带，而20 ng时谱带更清晰，模板量在30～50 ng时，随着模板量的增加，扩增的谱带亮度反而减弱，只有少量主带较亮。因此在冬虫夏草ISSR-PCR反应中，DNA最佳用量为20 ng。

图6 不同模板用量的电泳图谱

2.7 退火温度对ISSR-PCR的影响

运用Biometra公司的梯度PCR仪进行扩增，图7为835号引物进行的退火温度梯度试验。从图7中可知当退火温度在49.6～52.0℃之间时扩增条带清晰、稳定。低于或高于此范围都将不出带或出现弱带现象。因此试验中835号引物最佳退火温度选择为50.8℃。

图7 835号ISSR引物不同退火温度电泳图谱

3 讨论

ISSR-PCR扩增中DNA模板的质量是决定扩增效果的重要因素，在一定范围内随着模板量的增加，PCR扩增的条带数随之增加；但随着模板量的继续增加，扩增条带数减少即小片段产物减少，非特异性增强。为保证有较好的特异性，引物与模板的结合程度和结合量也要保持适当的比例。试验得出在模板量不变的条件下，引物浓度低时有利于大片段的扩增，引物浓度高时则更有利于小片段的扩增。

Mg2+对扩增结果也起到重要的影响。Taq DNA聚合酶的活性离不开Mg2+，Mg2+通过影响酶进而影响PCR结果。Mg2+浓度过低时酶的活性得不到提高，过高时酶的活性又会受到抑制。同时由于溶解DNA的缓冲液TE中含有EDTA，会螯合Mg2+；加上dNTP中的磷酸基团能和Mg2+结合，使反应体系中Mg2+的实际浓度降低，进而降低Mg2+浓度以致影响酶活性。

试验得出，引物的退火温度对PCR扩增结果有明显的影响。不同的引物具有不同的最适退火温度，需要进行逐一筛选以获得较为稳定的标记结果。在运用的10条引物中各引物的退火温度表现出了相同的趋势即退火温度低于或高于最适退火温度时都会出现缺带或弱带的现象。

4 结论

在反应体系中各组分的含量和扩增条件的选择都会对试验结果造成影响。在建立反应体系时为了得到可靠的、稳定的、重复性好的扩增结果，同时从经济角度考虑，在得到相同试验结果的条件下，应选择药品用量少的反应体系组成。最后，本试验确立了冬虫夏草ISSR-PCR反应25μL体系为：10×PCR Buffer 2.5μL；模板DNA 20 ng；ISSR 引物0.9μmol/L；dNTP 0.12 mmol/L；Mg2+1.5 mmol/L；Taq DNA 聚合酶0.5 U。

[1]孙爱红，左雪枝.冬虫夏草研究进展 [J].安徽农业科学，2007，35（27）：8521-8522，8598.

[2]Artjariyasripong S,Mitchell J I,Hywel-Jones N L,et al.Relationship of the genus Cordyceps and related genera,based on parsimony and spectral analysis of partial 18Sand 28Sribosomal gene sequences[J].Mycoscience,2001,42（6）:503-517.

[3]Nikoh N,Fukatsu T.Interkingdom host jumping underground:phylogenetic analysis of entomoparasistic fungi of the genus Cordyceps[J].Molecular Biology and Evolution,2000,17（4）:629-638.

[4]陈永久，宿 兵，王 文，等.用RAPD标记分析冬虫夏草（Cordyceps sinensis[Berk.]Sacc）个体的遗传特性[A].中国菌物学会虫生真菌专业委员会，中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学开放实验室.中国虫生真菌研究与应用 [C].北京：中国农业科学技术出版社，1997.97-101.

[5]Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20:176-183.

[6]Brantestam A K,BothmerR V,Dayteg D.Zntersimple sequence repeat analysis of genetic diversity and relationshipsin cultivated barely of Nordic and Balticorigin[J].Hereditas,2004,144:186-192.

[7]陈永久，王 文，杨跃雄，等.冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的随机扩增多态DNA及其遗传分化[J].遗传学报，1997，24（5）：410-416.

[8]王 瑜，袁庆华.紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J].草地学报，2007，15（3）：212-215.

[9]范 彦，曾 兵，张新全，等.中国野生鸭茅遗传多样性的ISSR研究[J].草业学报，2006，15（5）：103-108.

[10]任军方，唐龙祥.槟榔基因组DNA提取及ISSR反应体系的优化[J].湖南农业科学，2010，（5）：1-4.

[11]彭 海，张 静，李晓斐，等.引物浓度与退火温度对ISSR扩增片段大小的选择性[J].安徽农业科学，2007，35（17）：5089-5090.