大鼠视网膜色素上皮细胞分离的改良及其MMP表达

黄琛，李颖，陈晓勇，许永根，张纯，王薇

(北京大学第三医院眼科，北京大学眼科中心，北京 100191)

研究报告

大鼠视网膜色素上皮细胞分离的改良及其MMP表达

黄琛，李颖，陈晓勇，许永根，张纯，王薇

(北京大学第三医院眼科，北京大学眼科中心，北京 100191)

目的探索和优化大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞分离培养的方法，评价RPE细胞的存活状态及细胞基质金属蛋白酶(MMP)的表达，为相关眼底疾病的研究提供细胞来源。方法采用改良的三步酶消化法分离大鼠RPE细胞，并进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态，细胞生长曲线评价不同培养代数的RPE细胞的增殖活力。免疫荧光检测CRALBP和角蛋白表达鉴定RPE细胞，并观察不同培养代数RPE细胞中多种基质金属蛋白酶的表达。结果分离培养的RPE细胞可呈梭形、六角形，并维持RPE细胞特征性蛋白CRALBP和角蛋白表达，但细胞内色素成分随着细胞分裂和传代次数的增多逐渐减少。基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10在第1代和第3代RPE细胞中均表达阳性，且表达强度未见明显改变。结论应用改良的三步酶消化法可以成功的分离培养大鼠RPE细胞，并在第1代和第3代RPE细胞维持基质金属蛋白酶MMP2、MMP3、MMP9和MMP10的阳性表达。体外培养的大鼠RPE细胞为研究视网膜相关疾病提供了细胞模型。

视网膜色素上皮细胞;基质金属蛋白酶;细胞培养;大鼠

视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道，参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性［1，2］。充分体现了RPE在维持视网膜神经上皮结构及功能稳定所发挥的重要作用。在增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)、视网膜新生血管性疾病中均涉及RPE细胞的游离、增殖和迁移，其过程可能与RPE细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)有关［3］。基质金属蛋白酶是一组Zn2+离子依赖性内肽酶，主要功能是降解细胞外基质，在细胞迁移、组织重建和修复等病理生理过程中发挥作用。

含色素的Brown Norway(BN)大鼠的视网膜结构与人类相似，可作为动物模型用于多种视网膜相关疾病的研究。但由于大鼠眼球小，RPE细胞层与视网膜神经上皮层、脉络膜连接紧密，使体外分离培养获得的RPE细胞量少，容易混杂其他视网膜组织细胞或脉络膜细胞，不利于进一步的体外研究。本研究采用改良的三步酶消化法成功分离和培养大鼠RPE细胞，并对其基质金属蛋白酶表达进行分析。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料、试剂及仪器

DMSO(Sigma公司，美国);DMEM－F12培养液(Gibco公司，美国);MTT(Sigma公司，美国);酶联免疫测定仪(BioRad公司，美国);CO2恒温细胞培养箱(Sanyo公司，日本);倒置荧光显微镜(Nikon公司，日本);6孔－，12孔－，96孔细胞培养板，100 mm细胞培养皿(Corning公司，美国)。

1.2 大鼠RPE细胞体外分离和培养

健康雄性BN大鼠，体重200～250 g，麻醉后处死，75%酒精浸泡10 m in，无菌条件下摘取眼球，修剪眼球壁软组织后置入含有400 U/m L庆大霉素的生理盐水中，4℃下放置30 min。至角膜缘后环形剪去眼球前节，初步去除玻璃体。采用215 U/ m L透明质酸酶进行第一步酶消化，室温消化眼杯3 min，用眼科镊进一步去除视网膜神经上皮表面的残存玻璃体。在视网膜神经上皮表面滴加含有215 U/m L透明质酸酶、0.125%胰蛋白酶－0.01% EDTA的消化液，室温消化3 min，进行第二步酶消化。将松解脱离的神经上皮层轻轻揭去，再加入0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液，置于37℃细胞培养箱中消化15 min，进行第三步酶消化。加入含有10%胎牛血清DMEM－F12培养基终止消化，用吸管轻轻吹打使RPE细胞脱离，将RPE细胞悬液以(4～5)×104/m L接种于培养板中，置37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，48 h后，完全培养基换液，待细胞汇合80%时，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化，传代培养。倒置显微镜下观察细胞形态。

1.3 生长曲线(M TT法)

取对数生长期第一代、第三代、第六代大鼠RPE细胞，0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液消化后制备成单细胞悬液，以5×103个细胞/孔接种于96孔板，将其置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天每种细胞取6孔采用MTT法检测细胞活性。每孔待测的细胞加入MTT 50 μL，继续培养4 h，吸弃原液，每孔加入DMSO 150 μL，室温震荡15 m in。采用酶联免疫检测仪在490 nm波长处测定各孔的吸光度值。连续培养7d，绘制细胞生长曲线。

1.4 免疫荧光

细胞爬片经固定、漂洗、破膜处理后，加入正常的山羊血清封闭，然后分别加入抗CRALBP、角蛋白8、MMP2、MMP3、MMP9、MMP10抗体，再次漂洗后加入TRITC标记的IgG二抗，然后用Hoechst 33342染核。

2 结果

2.1 大鼠RPE细胞的原代及传代培养

刚刚分离的大鼠RPE细胞呈圆形，大小均一，胞质内含大量黑色或褐色色素颗粒，细胞核不可见。RPE细胞在接种24 h后完全贴壁，细胞伸展，成多角形或不规则形，色素颗粒聚集在细胞核周围，细胞核清晰可见。接种48 h后，细胞开始分裂增殖，可见明显的双核细胞。原代培养的细胞在5 d左右融合，传代培养的细胞3 d左右融合。随着细胞分裂的进行，细胞内色素逐渐稀释减少，细胞逐渐透明，3～4代RPE细胞质中已无明显的色素颗粒。同时，细胞形态也发生改变，由原代的含大量色素的多边形细胞逐渐变成透明的长梭形细胞和不规则形(见图1)。

2.2 大鼠RPE细胞的生长曲线

RPE细胞接种后24 h，细胞生长缓慢，处于潜伏期。第1代和第3代大鼠RPE细胞在第2天进入细胞对数生长期，3～4 d生长显著，随后细胞生长进入稳定时期，且第1代细胞和第3代细胞生长曲线形状及吸光值无明显差异，提示这两代细胞具有相似的细胞增殖活性。而第6代细胞生长明显慢于第1、3代细胞(见图2)。

注:a.原代RPE细胞;b.第1代RPE细胞;c.第3代RPE细胞;d.第6代RPE细胞.图1大鼠RPE细胞培养Note:a.Primary passage RPE cells;b.Passage 1 RPE cells;c.Passage 3 RPE cells;d.Passage 6 RPE cells.Fig.1 Cultured rat RPE cells in vitro.

图2 大鼠RPE细胞生长曲线Fig.2 Growth curves of the rat RPE cells in different passages.

2.3 大鼠RPE细胞的鉴定

采用免疫荧光法检测第1代、第3代和第6代大鼠RPE细胞中，角蛋白8和CRALBP的表达。结果显示，角蛋白8和CRALBP在第1代、第3代和第6代RPE细胞均表达阳性，且表达强度未见明显改变(图3，彩插2)。

2.4 大鼠RPE细胞中基质金属蛋白酶的表达

如图4(彩插3)所示，第1代和第3代RPE细胞中MMP2、MMP3、MMP9和MMP10蛋白均表达阳性，且表达强度未见明显改变。而第6代RPE细胞中，MMP2和MMP3依然持续表达，MMP9和MMP10蛋白表达减弱。

3 讨论

大鼠作为动物模型已被广泛应用于光损伤、糖尿病视网膜病变等疾病的研究［4］。然而，由于大鼠眼球较小，RPE细胞层与视网膜神经上皮层、脉络膜连接紧密，传统的体外分离法获得的RPE细胞量较少，且易混杂其他视网膜和脉络膜组织细胞，阻碍了大鼠RPE细胞的体外研究应用。本研究采用三步酶消化法，首先在解剖显微镜下初步去除玻璃体后，采用215 U/m L透明质酸酶进行第一步酶消化。玻璃体主要由水、胶原纤维与透明质酸组成，单纯的透明质酸酶消化3min可以有效的解离视网膜神经上皮表面的残存玻璃体，使之易于去除，不会影响对视网膜组织的进一步消化。随后，在视网膜神经上皮表面滴加含有215 U/mL透明质酸酶、0.125%胰蛋白酶－0.01%EDTA的消化液，进行第二步酶消化。透明质酸酶和胰蛋白酶的混合液能有效松解视网膜神经上皮和RPE细胞层之间的紧密连接，确保在完全揭去神经上皮的同时不会带离其下的RPE细胞。最后采用胰蛋白酶消化RPE细胞，获得单细胞悬液。通过以上三步酶消化法，获得的RPE细胞数量多，细胞活力好，贴壁率高，体外生长旺盛。

大鼠原代RPE细胞长至融合时仍含有大量黑色素颗粒，并保持其原有的形态。RPE细胞在体外培养过程中不能产生黑色素，所以随着传代的递增，黑色素颗粒日趋减少。RPE细胞在第1代时色素颗粒明显减少，第3代细胞色素完全消失，细胞呈透明状。生长曲线结果显示，细胞传的代数越多，细胞活性则越不稳定，因此在进行RPE的相关实验时，可以采用第3代细胞进行实验。

本实验采用CRALBP和角蛋白8作为RPE鉴定的特异性抗体标志。CRALBP是视网膜RPE细胞中的功能蛋白，主要参与视觉环路中11－顺视黄醛的异构化过程，激发全－反视黄醛酶解转化为11－顺视黄醛［5］。角蛋白8是上皮细胞特异性的标志蛋白［6］。免疫荧光显示培养的RPE细胞CRALBP和角蛋白8持续阳性，进一步证实了本实验获得和培养的细胞为大鼠RPE细胞。

MMP是一组在结构上具有明显同源性的Zn2+依赖的内源性蛋白水解酶，是降解和重塑细胞外基质最重要的酶系统。目前研究认为，PVR基本病理过程是RPE细胞及神经胶质细胞的迁移、增生和收缩，并且与RPE细胞分泌MMP蛋白降解细胞外基质成分有关［7］。而在增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy，PDR)中，MMP蛋白的表达增加与新生血管形成密切相关［8］。在年龄相关性黄斑变性的特征性病变，黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成的早期，MMP活化是重要步骤。动物模型发现，MMP2和MMP9联合表达缺失的小鼠中，CNV产生明显少于MMP2、MMP9各自基因表达缺失的小鼠，提示MMP2和MMP9的联合作用对CNV产生的重要性［9］。本研究发现，在第1代和第3代体外培养的大鼠RPE细胞中MMP2、MMP3、MMP9和MMP10蛋白均表达阳性，且表达强度未见明显改变。而第6代RPE细胞中，MMP2和MMP3依然持续表达，MMP9和MMP10蛋白表达减弱。提示，培养第3代的大鼠RPE细胞最具代表性，适合用于体外研究。

本实验结果表明，三步酶消化法是一种简单有效的体外分离大鼠RPE细胞的方法，细胞收获量多，并能保持RPE的形态和功能正常。大鼠RPE细胞的成功体外培养为研究RPE细胞的功能、相关眼底病变机理及治疗提供可靠的体外手段。

(本文图3～4见彩插2，3。)

［1］Schraermeyer U，Heimann K.Current understanding on the role of retinal pigment epithelium and its pigmentation［J］.Pigment Cell Res，1999，12(4):219－236.

［2］Strauss O.The retinal pigment epithelium in visual function［J］.Physiol Rev，2005，85(3):845－881.

［3］Hoffmann S，He S，Ehren M，et al.MMP－2 and MMP－9 secretion by rpe is stimulated by angiogenic molecules found in choroidal neovascular membranes［J］.Retina，2006，26(4): 454－461.

［4］Yu DY，Cringle SJ.Retinal degeneration and local oxygen metabolism［J］.Exp Eye Res，2005，80(6):745－751.

［5］Saari JC，Bredberg L，Garwin GG.Identification of the endogenous retinoids associated with three cellular retinoidbinding proteins from bovine retina and retinal pigment epithelium［J］.J Biol Chem，1982，257(22):13329－13333.

［6］Agata K，Kobayashi H，Itoh Y，et al.Genetic characterization of the multipotent dedifferentiated state of pigmented epithelial cells in vitro［J］.Development，1993，118(4):1025－1030.

［7］Glaser BM，Cardin A，Biscoe B.Proliferative vitreoretinopathy. The mechanism of development of vitreoretinal traction［J］. Ophthalmology，1987，94(4):327－332.

［8］Beránek M，Kolar P，Tschoplova S，et al.Genetic variations and plasma levels of gelatinase A(matrix metalloproteinase－2) and gelatinase B(matrix metalloproteinase－9)in proliferative diabetic retinopathy［J］.Mol Vis，2008，14:1114－1121.

［9］Lambert V，Wielockx B，Munaut C，et al.MMP－2 and MMP－9 synergize in promoting choroidal neovascularization［J］.FASEB J，2003，17(15):2290－2292.

A M odified M ethod of Isolation of Rat Retinal Pigm ent Epithelial Cells and the Exp ression of M atrix M etallop roteinases in the Cu ltured Cells

HUANG Chen，LI Ying，CHEN Xiao－yong，XU Yong－gen，ZHANG Chun，WANG Wei
(Department of Ophthalmology，Peking University Third Hospital，Peking University Eye Center，Beijing 100191，China)

ObjectiveTo improve the isolation and culture techniques of rat retinal pigment epithelial(RPE) cells and investigate the expression of matrix metalloproteinases(MMPs)in the cultured RPE cells.M ethods The brown Norway(BN)rat RPE cells were isolated by a modified three－step enzyme digestion.The growth curves of the RPE cells of different passages were measured.The expression of marker protein CRALBP and cytokeratin，and MMPs in the RPE cells of different passages were observed by immunofluorescence microscopy.ResultsThe primary cultured RPE cells showed a polygonal shape and contained a large amount of pigments.The pigment in the cells was gradually lost at later passages as a result of dilution by cell division.Immunofluorescence microscopy detected the positive expression of specific markers CRALBP and cytokeratin in the RPE cells.Positive expressions of MMP2，MMP3，MMP9 and MMP10 were found in passage 1 and 3 RPE cells.ConlusionA larger amount of RPE cells can be obtained by this modified three－step enzymatic digestion.The positively passaged MMP2－，MMP3－，MMP9－and MMP10－expressing RPE cells may become useful cell models for further studies of retinal diseases.

Retinal pigment epithelial cell;Matrix metalloproteinase;Enzyme digestion;Cell culture;Rat

R779112

A

1005－4847(2010)02－0109－04

2009－09－15

国家自然科学基金(NO.30672284);中国博士后科学基金(20080430288)资助。

黄琛(1978－)，女，讲师，在站博士后。E－mail:candyhuang719@hotmail.com

王薇，教授。E－mail:puh3_ww@bjmu.edu.cn