参蛇偏瘫胶囊联合尼莫地平预处理对脑缺血后再灌注神经细胞凋亡的影响

张 慧

（山西大同大学医学院，山西大同 037009）

参蛇偏瘫胶囊由人参、白花蛇、水蛭、鳖甲、鹿角胶等15味名贵中药组成，具有益气补肾，活血化瘀，熄风通络之功效，临床治疗缺血性脑血管疾病疗效较好[1-2]。研究显示，凋亡是轻度脑缺血损伤中神经细胞死亡的重要过程，而Bcl-2可抑制这一过程[3]。本研究通过观察这两种常用药物联合使用对脑缺血的保护作用，及其与Bcl-2表达的影响来探讨其保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 昆明种小鼠，由山西农业大学动物医学实验教学中心提供。

1.1.2 药物 参蛇偏瘫胶囊（粉），郑州羚锐制药有限公司生产（国药准字：B20040027），1 g粉含饮片 4 g。尼莫地平片，石家庄市华龙制药股份有限公司生产。

1.1.3 试剂 DNA原位末端标记试剂盒为上海索莱宝生物科技有限公司产品；Bcl-2免疫组化试剂为南京凯基生物科技发展有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 分组和模型制备 成年小鼠50只，月龄3个月，雌雄不拘，单只体重50～70 g，随机分为5组，每组10只，即假手术组、模型组、尼莫地平组、参蛇偏瘫胶囊组、参蛇偏瘫胶囊联合尼莫地平预处理组（联合组）。结合Zea Longa等[4]和Chomczynski等[5]描述的方法，加以改动建立全脑缺血再灌注模型。小鼠3.5%水合氯醛（35 mg/100 g BW）腹腔注射麻醉后，分离双侧颈动脉并套以0号丝线，将双侧颈动脉同时结扎阻断并确定无血流通过后，30 min后切断丝线灌流10 min，再次阻断30 min后，放开线，使血流再通。术后观察行为、左侧上肢屈曲、行走左转或左侧跌倒者手术成功。

1.2.2 给药与取样 模型组给予脑缺血5 min后再灌注72 h，尼莫地平组在缺血前30 min静脉给予尼莫地平0.2 mg/kg；参蛇偏瘫胶囊组在缺血前30 min腹腔注射参蛇偏瘫胶囊混悬液10 ml/kg；联合组缺血前30 min腹腔注射参蛇偏瘫胶囊混悬液10 ml/kg，同时给予静脉注射尼莫地平0.2 mg/kg。假手术组仅分离颈部血管，各组均在脑缺血后5 min再灌注72 h后取脑组织。

1.2.3 凋亡细胞检测 依据Gavrieli等[6]描述的方法将DUTP生物素化后标记到DNA片段上，该生物素通过与亲合素的特异性结合，使该联合体结合在DNA的断点部位，加入过氧化物酶显色底物二氨基联苯胺（DAB）后，在原位出现棕褐色沉淀，着色者为凋亡细胞。

1.2.4 Bcl-2检测 Bcl-2多抗孵育后，依次滴加抗兔IgG、链霉卵白素（辣根酶标记）等试剂后孵育。阴性对照是用正常血清代替一抗，以已知阳性切片为阳性对照。观察Bcl-2免疫组化结果，根据文献[7]判定，阳性细胞的征象是胞浆内或核膜上出现棕黄色斑片或颗粒。高倍显微镜视野记计数200个神经元细胞中的阳性细胞比例，其中阴性为无神经元细胞着色，弱阳性＜25%着色，中强度阳性25%～50%着色，反应强度分别记 0、1、2、3 分。

1.3 统计学方法

应用SPSS 10.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析，方差不齐时采用近似t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组预处理后着色细胞变化的比较

见表1。由表1可知，联合组着色细胞率明显低于其他组（P＜0.05），假手术组无阳性细胞表达；尼莫地平组和参蛇偏瘫胶囊组着色细胞率低于模型组（P＜0.05），但与联合组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组预处理后Bcl-2表达变化的比较

见表1。由表1可知，模型组鼠皮质区锥体细胞呈弱阳性，而联合组皮质区Bcl-2蛋白免疫反应为强阳性，两组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01），与尼莫地平组、参蛇偏瘫胶囊组比较，差异也有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）。

3 讨论

凋亡是脑缺血损伤后神经细胞死亡的重要方式，且多发生在缺血再灌注24 h后，是迟发性神经元死亡的主要形式。细胞凋亡需要多种基因、蛋白的参与，其特征是DNA的有序降解，TUNEL法可较早地、高度敏感地发现这些片段[8]。因此本实验采用TUNEL法检测动物皮质区缺血再灌注后的细胞凋亡情况。本研究结果显示，脑缺血再灌注后出现皮质区锥体神经元的丢失现象，大量凋亡细胞呈现，提示细胞凋亡与迟发性神经元死亡的密切关联。

表1 各组皮层区细胞着色情况比较（±s）Tab.1 Comparison of colored situation cortex cells in each group(±s)

表1 各组皮层区细胞着色情况比较（±s）Tab.1 Comparison of colored situation cortex cells in each group(±s)

与模型组比较，#P＜0.05；与联合组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，△P＞0.05Compared with the model group,#P＜0.05;compared with the combination group,*P＜0.05，**P＜0.01，△P＞0.05

组别 只数 着色细胞数（%）假手术组模型组尼莫地平组参蛇偏瘫胶囊组联合组10 10 10 10 10 0 72.4±2.2*38.0±1.9*#△42.4±3.6*#△18.7±3.1反应强度（分）0.10±0.50 0.90±0.54**1.70±0.33*1.30±0.78**2.70±0.39

研究表明，Bcl-2在抗细胞凋亡作用中发挥重要作用，这种作用是多途径的[9]。Bcl-2的蛋白表达量与脑保护作用成正比。本研究结果表明，尼莫地平预处理组的Bcl-2蛋白反应强度大于假手术组，提示采用尼莫地平进行预处理有可能导致Bcl-2基因表达增强，从而减少凋亡细胞数。既往药理学研究成果显示，参蛇偏瘫胶囊君药人参的成分对脑缺血损伤具有较好的保护作用，本研究结果亦提示参蛇偏瘫胶囊对鼠脑缺血起到了保护作用。通过以上的分析，推测这种保护作用机制可能与其增强Bcl-2的表达和抑制BaX蛋白的表达，在某种程度上干预了细胞凋亡进程有关。

参蛇偏瘫胶囊与尼莫地平联合使用是否会产生协同效应，本实验通过比较经两者单独使用及联合预处理后的皮层区神经元的凋亡细胞百分率，可以看出参蛇偏瘫胶囊联合尼莫地平预处理的效果由于二者单独使用。这提示，药物联合应用可能是脑缺血损伤治疗的一条有效模式。

[1]张振强,荆志伟,樊小勇,等.参蛇偏瘫胶囊对局灶脑缺血大鼠脑保护作用的实验研究[J].中成药,2006,28(9)∶1059-1060.

[2]荆志伟,韩群英,张振强,等.参蛇偏瘫胶囊预防短暂性脑缺血发作的随机对照研究[J].辽宁中医杂志,2006,33(6)∶641-642.

[3]Basuroy S,Bhattacharya S,Leffler CW,et al.Akt/Bcl-2 signaling is critical for anti-apoptotic effects of carbon monoxide(CO)against TNF-alpha-mediated inflammatory damage in cerebral vascular endothelial cells[J].FASEB J,2010,24(4)∶979.

[4]Zea Longa E,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1)∶84-91.

[5]Chomczynski P,Sacchi N.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol chloroform extraction[J].Anal Biochem,1987,162(1)∶156-159.

[6]Gavrieli Y,Sherman Y,Ben Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of DNA fragmentation[J].J Cell Biol,1992,119∶493-501.

[7]张予阳,史琳琳,郝冬海,等.Bcl-2在缺血性神经细胞损伤中的作用及药物的影响[J].中国药理学通报,2010,26(1)∶21-24.

[8]Muratori M,Tamburrino L,Tocci V,et al.Small variations in crucial steps of TUNEL assay coupled to flow cytometry greatly affect measures of sperm DNA fragmentation[J].J Androl,2010,31(6)∶336-345.

[9]Zhang YY,Dong YL,Wu X,et al.The mitochondrial pathway of anesthetic isoflurane-induced apoptosis[J].J Biol Chem,2010,285(2)∶4025-4037.