两步法制备高活性酪蛋白ACE抑制肽的工艺参数研究

李亚云，赵新淮*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

两步法制备高活性酪蛋白ACE抑制肽的工艺参数研究

李亚云，赵新淮*

(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

为了制备高活性ACE抑制肽，研究两步法高活性酪蛋白ACE抑制肽的制备工艺条件参数。利用枯草杆菌碱性蛋白酶55℃水解酪蛋白6h制备酪蛋白ACE抑制肽，IC50为38.6μg/mL；采用相同的酶进行Plastein反应来修饰酪蛋白ACE抑制肽，并应用响应面分析法优化修饰反应条件。固定酪蛋白ACE抑制肽质量分数为35%，以ACE抑制肽的游离氨基减少量为指标，优化的修饰反应条件为酶添加量7.7kU/g蛋白质、温度42.7℃、反应时间6h，在此条件下，酪蛋白ACE抑制肽的游离氨基减少量达到179.72μmol/g蛋白质。ACE抑制活性分析结果表明，修饰后ACE抑制肽的抑制活性显著提高且与修饰反应程度相关，IC50可降至0.5μg/mL。

酪蛋白；ACE抑制肽；制备工艺；Plastein反应

Abstract：The ACE inhibitory peptides derived from casein hydrolyzed with alkaline protease from Bacillus subtilis at 55 ℃for 6 h exhibited an IC50of 38.6μg/mL. To enhance their activity, they were modified via the plastein reaction catalyzed by the enzyme. Moreover, response surface methodology was employed to investigate the optimal values of plastein reaction parameters including enzyme dosage and reaction temperature and time. Results showed that after the optimal reaction for 6 h at 42.7 ℃and an enzyme dosage of 7.7 kU/g protein, the content of free amino groups in the peptides were decreased by up to 179.72 μmol/g protein. The optimized plastein reaction resulted in an obvious enhancement of casein-derived ACE inhibitory peptides, which was related to the reaction degree and the IC50of the modified ACE inhibitory peptides was reduced to 0.5μg/mL.

Key words：casein；ACE inhibitory peptides；preparation method；plastein reaction

蛋白质经蛋白酶水解后，产生分子质量不等的肽类，这些肽类的功能性质尤其是生物活性可能发生显著变化[1-2]。酪蛋白作为主要的食品蛋白质来源之一，是制备生物活性肽的重要原料[3-4]，可以制备ACE抑制肽、抗氧化肽等。血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽以其安全性等优点具有研究和实用价值[5]。目前，国内外对ACE抑制肽的制备研究，主要集中在蛋白酶和蛋白质的选择[6-7]、酶解条件和相关制备参数的优化[8-9]等方面。这些研究的特征是，在从蛋白质底物制备ACE抑制肽时无论是利用单一蛋白酶或复合蛋白酶的催化作用，均为一步法酶水解或者是连续酶水解的过程。因此，此类方式的制备技术必然导致ACE抑制肽的氨基酸序列结构受限制于原料蛋白质的一级结构，即ACE抑制肽的活性高低受限制于蛋白质底物。故此，采用修饰技术手段来提高蛋白质水解物的ACE抑制活性，制备高活性的ACE抑制肽，是一个令人十分感兴趣的技术问题，甚至可能涉及新的理论问题。

Plastein反应是浓缩的蛋白水解物在合适条件下经蛋白酶作用形成凝胶状物质的反应，它通常被认为是蛋白质水解反应的逆反应[10]。Plastein反应过去常被用于改善蛋白质氨基酸组成[11]，提高蛋白质功能性质[12]等方面。Plastein反应所涉及的机理复杂，至少存在3种不同理论[13-15]；缩合作用、转肽作用、物理聚集。Plastein 反应中的转肽作用和缩合作用涉及在肽分子之间有新肽键的生成，而缩合作用还涉及到反应底物中游离氨基的减少。所以，蛋白质水解物在进行Plastein反应时，底物游离氨基减少量可以反映Plastein反应的程度。由于Plastein 反应中的转肽作用和缩合作用涉及新肽键的生成，这就意味着蛋白质水解物通过Plastein反应修饰后，有可能生成在原料蛋白质中不存在的某些新肽段，从而影响到最终产物的ACE抑制活性。目前尚未发现有其他的研究者利用Plastein反应来制备ACE抑制肽的相关报道。为此，本研究尝试两步法制备酪蛋白ACE抑制肽。首先，利用碱性蛋白酶水解酪蛋白获得一定活性大小ACE抑制肽，然后应用碱性蛋白酶催化的Plastein反应对ACE抑制肽进行第二步修饰；以反应底物(ACE抑制肽)游离氨基减少量为指标，重点地应用响应面分析法对修饰反应进行优化，建立相应的数学模型；最后对一些修饰产物的ACE抑制活性进行评价、比较。研究结果可以确定Plastein反应修饰制备高活性ACE抑制肽的可行性，以及两步法的技术路线参数。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白(蛋白质含量95.7%) 上海山浦化工有限公司；碱性蛋白酶 南宁庞博生物工程有限公司；FAPGG(FA-Phe-Gly-Gly)；兔肺丙酮粉 Sigma公司；卡托普利(Captopril) Fluca公司；其他所用试剂均为分析纯试剂，所用水为去离子水。

1.2 仪器与设备

UV-2401PC紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；DELTA 320精密pH计 梅特勒-托利多中国有限公司；KjeltecTM2300全自动凯氏定氮仪 丹麦Foss公司；G1-21M冷冻离心机 上海市离心机械研究所；LGJ-1真空冷冻干燥机 上海医用分析仪器厂；HZQ-F160全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公；H-1微型漩涡混合器 上海精科实业有限公司；DK-98-1电热恒温水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

图1 高活性酪蛋白ACE抑制肽的制备工艺流程Fig.1 Production flow chart of casein-derived ACE inhibitory peptides with high activity

1.3.2 ACE抑制肽的制备

将酪蛋白配制成质量分数10%溶液并用2mol/L的NaOH溶液调节pH8.5，加入碱性蛋白酶(10kU/g蛋白质)，55℃下水浴中水解6h；95℃条件下灭酶处理15min，冷却至室温后5000r/min离心20min以除去不溶性沉淀。测定上清液(酪蛋白水解物)的蛋白质含量和游离氨基含量，计算水解度。取1mL上清液，一定倍数稀释后测定其ACE抑制活性。上清液冷冻干燥后得到酪蛋白ACE抑制肽，并保存于－20℃待后续研究。

1.3.3 ACE抑制肽的Plastein修饰反应优化

用碱性蛋白酶催化Plastein反应，固定底物(酪蛋白ACE抑制肽)质量分数为35%，研究3个因素(碱性蛋白酶添加量、反应温度、反应时间)对修饰反应的影响行为，以反应底物的游离氨基减少量为响应值，根据中心组合试验设计原理，采用三因素五水平响应面分析方法，其因素水平编码见表1。

表1 响应面分析的因素水平编码表Table 1 Variable and levels in central composite design

1.4 相关分析

1.4.1 蛋白质含量、水解度以及酶活力的测定

蛋白质含量：按照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》[16]测定。

游离氨基含量与蛋白质水解度(DH)测定：采用邻苯二甲醛(OPA)法[17-18]。

OPA试剂的配制：准确称取2.00g 十二烷基磺酸钠(SDS)，加入30mL pH9.5的硼酸缓冲液，水浴加热使其完全溶解，冷却至室温后再加入1mL 80mg/mL的OPA乙醇溶液和200μL β-巯基乙醇，最后用硼酸缓冲液定容至100mL。此溶液现用现配。

样品溶液稀释1000倍后，取3mL样品稀释液或标准溶液与同体积的OPA试剂混合并开始计时，准确计时5min，立即在分光光度计上测定，波长为340nm。以亮氨酸溶液(12～36μg/mL)为标准溶液绘制标准曲线，利用标准曲线计算样品中游离氨基的浓度(μmol/mL)。水解度计算公式[19]如下：

酶活力测定：采用SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》[20]测定。

1.4.2 ACE抑制活性测定[21]

ACE酶液：50mg兔肺丙酮粉浸泡于5mL预冷至4℃的硼酸缓冲液(pH8.3，100mmol/L)中，4℃保持12h后于20000r/min冷冻离心40min，收集上清液并4℃保存。

FAPGG底物溶液：将FAPGG溶于pH8.3 100mmol/L的硼酸缓冲液(含300mmol/L NaCl)，配制成1.6mmol/L的溶液。

500μL FAPGG底物溶液与100μL超纯水或抑制剂(ACE抑制肽或卡托普利)混匀，37℃预热2min，加入300μL ACE酶液开始反应，在37℃反应30min后，立即加入100μL EDTA(100mmol/L)终止反应，加入4mL超纯水稀释，平行3次。0min样品的测定，要先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。340nm处分别测体系在0min和30min时的吸光度，计算差值ΔA(ΔA=A0min－A30min)。以单位时间内吸光度的变化表示ACE酶活力，抑制剂对ACE的抑制程度应用下式计算[6]：

式中ΔAc为加入超纯水时吸光度在30min内的变化；ΔAi为加入抑制剂时吸光度在30min内的变化。

IC50定义为抑制50% ACE酶活力时所需抑制剂的浓度，通过下式将ACE抑制活性转换成IC50[6]：

式中：IC为测定过程中抑制剂浓度/(mg/mL或nmol/L)；v为加入抑制剂后测得的相应酶活力/%(v=100－ACE抑制活性)。本研究中卡托普利的IC50测定值为5.2nmol/L。

1.5 统计分析

用Design Expert 7.0软件中Response Surface程序进行分析，用Model Graphs程序作响应曲面图和等高线图。

2 结果与分析

2.1 酪蛋白ACE抑制肽的制备

大多数ACE抑制肽是由2～12个氨基酸残基组成的小肽[2]，这需要酪蛋白的深度水解才能达到。利用前期研究所选定的水解条件，碱性蛋白酶水解酪蛋白6h，获得ACE抑制活性较强的酪蛋白水解物。测定结果显示，其IC50为38.6μg/mL(表4)。通过测定、计算，酪蛋白水解物的DH为11.2%。以后就以此水解物(酪蛋白ACE抑制肽)作为底物，研究第二步Plastein修饰反应的适宜条件参数，以及修饰反应对它的ACE抑制活性的影响作用。

2.2 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反应条件优化

2.2.1 回归方程的建立与分析

表2 中心组合试验设计及结果Table 2 Central composite design matrix and experimental results of decrease of free amino groups in casein-derived ACE inhibitory peptides before and after modification

前期研究发现，Plastein反应修饰时，底物浓度过大则体系的黏度太大而不利于反应；底物浓度过低则导致发生水解反应；适宜的底物浓度为35%(m/m)[22]。为了确定其他的适宜条件参数，按照中心组合设计的统计学要求，进行20组试验，以Plastein反应过程中底物游离氨基减少量(底物反应前的游离氨基含量减去反应后产物的游离氨基含量)为响应值Y，试验设计和结果见表2。

利用Design-Expert软件对表2中的数据进行二次多项回归拟合，剔除不显著的因子，获得底物游离氨基减少量(Y)与酶添加量(X1)、反应温度(X2)和反应时间(X3)关系的二次多项式回归方程为：

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic polynomial model

由表3分析结果看出，所得模型显著(P＜0.0001)，失拟检验不显著(P=0.2353)，模型与实际情况拟合较好(R2Adj= 0.9803)，可以很好地反映反应过程中底物游离氨基减少量的变化，用于实际反应情况预测。分析还表明，各因素对底物游离氨基减少量的影响顺序为反应温度＞反应时间＞酶添加量。通过回归方程所作的响应面曲面图及其等高线图，如图2～4所示。

酶添加量和反应温度对产物的游离氨基减少量交互作用的响应面及等高线图见图2。二者之间的交互作用较小，当酶添加量一定时，所选反应温度范围内产物的游离氨基减少量随反应温度的升高而增加，这一现象与反应温度升高能提高反应速率以及碱性蛋白酶的最适催化温度有关。另外，当反应温度一定时，产物的游离氨基减少量先逐渐增加后逐渐降低。从等高线图中可以看出，当反应时间为5h时(0水平)，酶添加量为6.8～8.5kU/g蛋白质、反应温度为28～42℃时，产物的游离氨基减少量较大。

酶添加量和反应时间交互作用的响应面和等高线见图3。二者之间的交互作用较大，随着反应时间延长、酶添加量的增加，产物的游离氨基减少量先逐渐增加，然后逐渐减少。从等高线图中可见，当反应温度为30℃时(0水平)，酶添加量为6.7～8.5kU/g蛋白质、反应时间为4.7～7.7h时，产物的游离氨基减少量较大。

反应温度和时间交互作用的响应面和等高线见图4。从等高线图中可见，当酶添加量为7.5kU/g蛋白质时(0水平)，反应温度为30～42℃、反应时间为3.7～7.7h时产物的游离氨基减少量较大。在所选的反应温度和时间范围内，反应温度和时间对产物的游离氨基减少量的单独作用都非常显著，但是它们的交互作用不显著，这可能是由于在所选的反应温度范围内，升高温度对反应速率的影响最大。

对回归模型进行数学分析，计算得到极大响应值和对应的因素条件为：酶添加量(X1)为7.7kU/g蛋白质、反应温度(X2)42.7℃、反应时间(X3)为6h，产物的游离氨基减少量(Y)为185.66μmol/g蛋白质。

2.2.2 Plastein反应条件的验证实验

采用上述优化得到的Plastein反应条件进行实际反应，测得产物的游离氨基减少量为179.72μmol/g蛋白质(3次结果的平均值)，与理论值(185.66μmol/g蛋白质)相比无显著差别，说明响应面法优化得到的工艺条件参数准确可靠。

2.3 酪蛋白ACE抑制肽的Plastein反应修饰与抑制活性变化

对先前制备出的酪蛋白ACE抑制肽进行Plastein反应修饰，通过改变反应时间，制备出修饰反应程度不同(游离氨基减少量不同)的3个产物，它们的ACE抑制活性(3次平均值)和IC50值列于表4。在相同的最终浓度下(0.01mg/mL)，修饰反应前的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性为20.59%，相应的IC50为38.6μg/mL；经过Plastein反应修饰后，产物的ACE抑制活性发生显著变化。当产物的游离氨基减少量为83.59μmol/g蛋白质，其ACE抑制活性为22.06%，相应的IC50降低至35.3μg/mL，相比底物差异不大；当产物的游离氨基减少量为129.57 μmol/g蛋白质(即进一步减少了约46μmol/g蛋白质)，其ACE抑制活性为42.65%，相应的IC50降低至13.4μg/mL，与底物相比差异很大；当产物的游离氨基减少量为179.72μmol/g蛋白质(即再一次减少了约50μmol/g蛋白质)，其ACE抑制活性达到95.59%，相应的IC50降低至0.5μg/mL，与底物相比差异极大。表4中的分析数据表明，Plastein反应修饰处理确实提高了酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性，并且Plastein修饰反应程度越大，酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性越高，显示出与修饰反应程度(产物的游离氨基减少量)之间存在一定的关联性，但是相关的分子机制有待于今后的研究来揭示。无论如何，研究结果亦表明利用两步法、采用Plastein反应修饰制备高活性酪蛋白ACE抑制肽的可行性。

表4 Plastein反应修饰对酪蛋白ACE抑制肽活性的影响Table 4 Influences of plastein modification on ACE inhibitory activity of casein hydrolysates

3 结 论

采用两步法可以从酪蛋白制备出高活性的酪蛋白ACE抑制肽。首先用碱性蛋白酶在55℃条件下酶解10%(m/m)酪蛋白溶液6h，分离后制备出水解度为11.2%、抑制活性为20.59%、IC50为38.6μg/mL的酪蛋白ACE抑制肽；然后，利用Plastein反应对ACE抑制肽进行修饰，最终得到的ACE抑制肽的ACE抑制活性显著提高，活性达到95.59%，IC50值降低至0.5μg/mL。

应用响应面分析法建立了Plastein修饰反应的数学模型，得到的优化反应条件为：酪蛋白ACE抑制肽质量分数固定在35%时，酶添加量7.7kU/g蛋白质、反应温度42.7℃、反应时间6h，此条件下酪蛋白ACE抑制肽的游离氨基减少量约为179.72μmol/g蛋白质。

修饰后的酪蛋白ACE抑制肽的抑制活性与Plastein反应程度存在一定的关联性，此问题有待于进一步研究。

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Two-step Alkalinase Hydrolysis for Production of Casein-derived ACE Inhibitory Peptides with High Activity

LI Ya-yun，ZHAO Xin-huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

TS201.1

A

1002-6630(2010)10-0006-06

2009-08-20

国家“863”计划项目(2006AA10Z324)；国家自然科学基金项目(30972132)

李亚云(1982—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：cloud125531@yahoo.com.cn

*通信作者：赵新淮(1963—)，男，教授，博士，研究方向为食品化学。E-mail：zhaoxh@mail.neau.edu.cn