响应面法优化杭白菊花精油的提取工艺及其化学成分研究

沈懋文，邵亮亮，侯付景，樊艳凤，管永芳，苏秀榕*

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

响应面法优化杭白菊花精油的提取工艺及其化学成分研究

沈懋文，邵亮亮，侯付景，樊艳凤，管永芳，苏秀榕*

(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211)

为了综合利用杭白菊花精油，对其提取工艺进行优化。利用超临界CO2流体萃取技术，响应面法优化萃取压力、萃取温度、萃取时间对杭白菊精油提取率的影响，以确定超临界CO2萃取杭白菊精油的最优条件；利用模型的响应曲面图及其等高线图，对影响超临界CO2萃取杭白菊精油提取率的关键因素及其相互作用进行探讨，得到的优化工艺参数为萃取压力25MPa、萃取温度74.9℃、萃取时间186.3min时，萃取效果最佳，理论提取率为3.51%；实际提取率为3.464%，比理论值低1.28%。气相色谱-质谱对挥发油化学成分进行分析，鉴定出44种化合物，应用面积归一化法测定各成分的相对百分含量。已鉴定化合物组分占总提取物的72.3%，其中有20种相对百分含量大于1%。

超临界萃取；响应面；杭白菊花精油；化学成分

Abstract：The optimal conditions (namely extraction pressure, temperature and time) for the supercritical CO2extraction of volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium were investigated using response surface methodology (RSM) based on a 3-variable, 3-level Box-Benhnken experimental design leading to 15 experiments. Meanwhile, the extracted volatile oil was analyzed for chemical composition. Computer generated response surfaces, canonical analysis and contour plot interpretation revealed that the optimal values of extraction pressure, temperature and time were 25 MPa, 74.9 ℃ and 186.3 min, respectively.Under such conditions, the experimental and predicted values of volatile oil yield was 3.464% and 3.51% and the former was 1.28% lower than the latter. Totally 44 compounds were identified by GC analysis in the extracted volatile oil and their total content was determined by the area normalization method to be 72.3%, of which, 20 exhibited a relative content of more than 1%.

Key words：supercritical CO2extraction；response surface methodology；volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium；chemical composition

精油也称挥发油，是存在于植物体中的一类具有芳香气味，在常温下能挥发，可随水蒸气蒸馏出来的油状液体的总称。在医学领域，植物精油在去痛、降压、消炎、提高免疫活力、保健、调节内分泌等方面得到了广泛的应用。在化妆品方面，植物精油被广泛应用于香水、香皂、洗面奶、护肤品等各种化妆品的制造。此外，植物精油在饲料和食品添加剂、防止虫害等方面也有广泛的应用价值[1-2]。我国的自然条件适合于各种天然香料植物的生长，蕴藏着极为丰富的天然香料资源，是发展天然香料的有利条件。含精油较为丰富的植物科属有松柏科、木兰科、樟科、芸香科、伞形科、唇形科、姜科、菊科、金娘科、龙樟香科、禾本科等[3]。杭白菊(Chrysanthemum morifolium)是浙江省八大名药材“浙八味”之一。因其优良的治病保健、延年益寿功效而驰名中外，并载入历代诸家本草，被人们亲切地冠以“延寿客”的嘉名[4-5]。精油的传统提取方法主要有有机溶剂萃取法、水蒸气蒸馏法，存在萃取率低、溶剂残留、产物香型变化、香气强度低等缺点[6]。而二氧化碳超临界萃取可以在常温下进行，无毒、无残留，而且香型逼真、香气强度高[7-8]。本研究在单因素的基础上利用响应面确定影响杭白菊精油提取率的主要因素及其相互关系，并拟合得到回归方程，优选出最佳工艺条件，为工业生产开发提供有价值的工艺参数[9]，并利用气-质谱联用仪对精油的成分进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

杭白菊取于浙江桐乡产的东方牌杭白菊。

CO2(纯度99.5%以上) 宁波方馨气体有限公司；化学试剂(均为分析纯) 宁波博奥化学试剂有限公司。SpeedTMSFE-2型二氧化碳超临界流体萃取仪 美国Applied Seperations公司。

1.2 方法

1.2.1 菊花预处理

将杭白菊于50℃干燥3h，用高速药物粉碎机粉碎，过40目筛，称取20g粉末待用。

1.2.2 响应面设计

利用二氧化碳超临界流体萃取仪，以压力、温度和时间因素，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理采用响应面法在三因素三水平上对杭白菊精油的提取条件进行优化，试验设计见表1。

表1 因素水平表Table 1 vairables and levels in Box-Benhnken experimental design

1.2.3 数据分析

利用SAS8.0和EXCEL进行数据分析。

1.2.4 GC-MS分析杭白菊精油

色谱条件：毛细管柱：(30m×0.25mm，0.25μm)；高纯氦气，柱流量为1.0mL/min；分流进样，分流比50:1；进样量0.5μL；柱温：起始温度50℃，保持2min；以5℃/min升至260℃，保持5min。

质谱条件：电离方式EI，电离电压70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接温度280℃，电子倍增器电压1340V，扫描质量范围50～550u，溶剂延迟2.0min。

2 结果与分析

2.1 提取条件

表2 杭白菊精油萃取响应面试验设计及结果Table 2 Box-Benhnken experimental design matrix and corresponding experimental values of volatile oil yield

表2中，试验1～12为析因试验，13～15为中心试验。15个试验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点, 零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计试验误差。

采用Design-Expert 7.1.3 软件对所得数据进行ANOVA分析，分析结果见表3。3个因素经过拟合得到的二次多元回归方程为：

表3 响应面方差分析Table 3 Analysis of variance for volatile oil yield with various extraction conditions

从表3的方差分析可见，二次多项式模型的F值为13.45，P值为0.0053＜0.05，说明用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，因其变量和自变量之间的线性关系显著，即这种试验方法是可靠的。相关系数R2=0.9697，说明杭白菊精油提取率的试验值与预测值之间有较好的拟合度。由回归方程各项的方差分析结果还可以看出方程的失拟项很小，表明该方程对试验拟合情况好，误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对结果进行分析和预测。从回归方程各项方差的进一步检验也可看出，一次项中极显著的因素为X1，影响显著因素为X3。在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：X1＞X3＞X2，即萃取压力＞萃取时间＞萃取温度。3个因素中，压力和温度之间存在较为显著的交互作用。

2.2 等高线图和响应面分析

图1 萃取温度和萃取压力对提取率影响的响应面图和等高线图Fig.1 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction temperature and pressure on volatile oil yield

图1直观地给出了萃取温度和萃取压力交互作用的响应面图和等高线分析图。等高线的形状反映出交互效应的大小，圆形表示两因素交互作用不显著，椭圆形则表示两因素交互作用显著。从其等高线图可以直观的看出两因素的交互作用显著，等高线沿压力轴变化相对密集，说明萃取压力对响应峰值的影响比温度大。在低压条件下，随着萃取温度的升高，提取率反而先升后降；而在高压条件下，提取率基本呈上升趋势，当温度过高后才开始下降。呈现这一规律的原因在于：超临界CO2萃取杭白菊精油的溶解能力主要决定于CO2流体密度，而萃取压力与萃取温度的改变是CO2流体密度变化的主要决定因素，随着萃取压力和温度的增加，CO2流体密度逐渐增加，CO2溶解能力增加，使得提取率有所增加；当萃取压力较低时，升温能够引起溶质挥发性增加，但不足以抵消CO2溶解杭白菊精油能力的降低，总的结果是溶剂相中精油的提取率减少。

图2 萃取时间和萃取压力对提取率影响的响应面图和等高线图Fig.2 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction time and pressure on volatile oil yield

由图2可知，压力与时间对提取率的交互影响不太显著，在压力与时间的交互作用等高线图中，沿压力轴方向的等高线密度变化明显高于时间方向的变化，说明在时间和压力的相互作用中，压力对杭白菊精油提取率的影响要大于时间。随着萃取压力的增加，精油的提取率是逐步增大的。这主要是因为萃取压力增加时，分子间平均间隙减小，溶质与溶剂间的亲和性增强，从而增加了溶剂的扩散与渗透能力，提高了超临界CO2的溶解能力。

图3 萃取时间和萃取温度对提取率影响的响应面图和等高线图Fig.3 Reponses surface plot and contour plot showing the interactive effects of extraction time and temperature on volatile oil yield

图3表明等高线密度沿时间轴方向略大于温度方向，说明在时间和温度的相互作用中，时间对杭白菊精油提取率的影响要大于温度。时间和温度编码值较大部分的响应值有减小趋势，可能是因为精油是热敏性物质，过高的温度会破坏它的成分。而提取率随时间上升到某一数值时就不会再增加。由Design-Expert软件分析得到的最大响应值(Y)时对应的编码值分别为X1=1、X2=0.49、X3=0.21，与之相应的超临界CO2萃取杭白菊精油的最佳条件为萃取压力25MPa、萃取温度74.9℃、萃取时间186.3min，理论最佳提取率为3.51%。

表4 杭白菊的超临界萃取精油的化学成分Table 4 Chemical composition of volatile oil from the flowers of Chrysanthemum morifolium

为了检验响应面法的可行性，采用得到的最佳提取条件进行杭白菊精油的验证实验。3次平行实验得到的实际平均提取率为3.464%，与理论值相差1.28%。因此，响应面法对杭白菊精油提取条件的优化是可行的，得到的精油提取条件具有实际应用价值。

2.3 GC-MS结果分析

对提取出的杭白菊精油进行气-质谱联用仪的分析，经过计算机谱库检索，查对有关质谱资料，分别对色谱峰加以确认，综合分析鉴定出以下化学成分，并按面积归一化法确定各组分相对百分比含量。由表4可以看出，利用响应面优化的最佳超临界萃取工艺提取的杭白菊精油，53种化合物，鉴定出了44种，已鉴定化合物组分占总提取物的72.3%，其中有20种相对百分含量大于1%。

3 结 论

传统的数理统计方法往往采用正交设计或均匀设计，可同时考虑几种因素，寻求最佳因素水平组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，即多项式回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。响应面分析方法是通过中心组合试验研究几种试验因素间交互作用的一种回归分析方法，具有试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高等优点，并从图形方面分析寻求最优试验考察因素值。目前已经在蛋白水解工艺上已经广泛使用[10]。本研究将响应面优化和超临界CO2萃取结合，模拟得到多项式回归方程，很直观的掌握各因素对杭白菊精油提取率的影响程度：萃取压力＞萃取时间＞萃取温度。确定了萃取时间对提取工艺有显著影响，萃取温度对提取工艺无显著性作用。经过方差分析得到最佳工艺参数为萃取压力25MPa、萃取温度74.9℃、萃取时间186.3min，精油提取率3.51%。这与传统提取方法相比，萃取时间短，节约能耗，无有机溶剂污染，提取率高[6,11]。

采用气质联用仪分析鉴定的杭白菊精油44种化合物中，主要成分为烯类、倍半菇烯类及其含氧衍生物等。这些化合物是存在于植物界的常见化合物，其生物活性是多方面的，并且是某些中药的主要有效成分，这对今后开发利用杭白菊成为保健食品及综合利用提供了科学依据。

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Response Surface Methodology as an Approach to Optimization of Supercritical CO2Extraction and Chemical Composition Analysis of Volatile Oil from Flowers of Chrysanthemum morifolium

SHEN Mao-wen，SHAO Liang-liang，HOU Fu-jing，FAN Yan-feng，GUAN Yong-fang，SU Xiu-rong*
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)10-0101-04

2009-09-15

浙江省回国人才基金资助项目

沈懋文(1985—)，女，本科生，研究方向为生物工程。E-mail：shenmaowen@nbu.edu.cn

*通信作者：苏秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向为食品科学与工程和生化与分子生物学。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn