鸭血小分子肽同步酶解工艺的优化

刘成梅，吴 孛，钟业俊，刘 伟，杨水兵，尹 曼

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

鸭血小分子肽同步酶解工艺的优化

刘成梅1,2，吴 孛1，钟业俊1,2，刘 伟1，杨水兵1，尹 曼1

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.南昌大学 生物质转化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047)

通过响应面分析，建立中性蛋白酶和风味蛋白酶同步酶解血浆蛋白的数学模型，方差和可信度分析表明该模型拟合度好(Root MSE=0.488768)。运用SAS软件分析得到最佳工艺参数为：pH7.1，反应温度50.5℃，酶解时间4.8h；在此条件下酶解所得小分子肽无异味，苦味轻，平均粒径为798.5nm，比表面为0.82634m2/g，Zeta电位为－8.63mV，吸水性为0.4388g/g，吸油性为8.323mL/g。

鸭血；中性蛋白酶；风味蛋白酶；酶解；响应面优化法

Abstract：Response surface analysis based on a 3-variable, 5-level quadratic orthogonal rotation combination design was employed to investigate the optimal conditions for the bi-enzymatic hydrolysis with Neutrase and Flavourzyme of duck plasma proteins for the production of small peptides. In the optimization, a mathematical model describing the degree of hydrolysis of duck plasma proteins as a function of pH and hydrolysis temperature and time was established. Variance and confidence analyses demonstrated satisfactory fitting degree of the model (Root MSE = 0.488768). The optimal values of pH and hydrolysis temperature and time were determined through data analysis using SAS software to be 7.1, 50.5 ℃ and 4.8 h. The small peptides obtained under such conditions had no unpleasant smell and exhibited a slight taste, 798.5 nm average particle size, 0.82634 m2/g specific surface area, －8.63 mV Zeta potential, 0.4388 g/g water absorption ability and 8.323 mL/g oil adsorption ability.

Key words：duck plasma；Neutrase；Flavourzyme；enzymolysis；response surface methodology

我国的畜禽血液资源非常丰富，但目前加工技术较为落后，产业化程度较低，除部分以血粉、血豆腐或饲料原料等初级加工形式利用之外，相当一部分以污水的形式排放或丢弃，利用率不到10%，致使大量宝贵营养资源流失，且造成严重的环境污染[1]。

鸭血中富含大量优质蛋白质，特别是占血液总蛋白质含量60%～70%的血红蛋白[2]，经水解出分离出来的小分子肽，不仅有很好的溶解性、低黏度、抗凝胶形成性，在体内不用消化可以直接吸收，还具有一系列重要的功能活性，如阿片样活性、ACE抑制活性、增强血管舒缓激肽活性、刺激细菌生长活性、镇痛活性、抗菌活性及抗氧化活性等[3]。

以畜禽血为原料，深加工开发小分子肽是当前的研究热点，但技术路线大多较为单一，纯度较低。目前主要技术有溶剂提取法、酸碱水解法和酶水解法[4-5]。有机溶剂提取法使用有机溶剂进行提取，但有机溶剂的残留使得产品存在安全隐患；酸碱水解法存在可控性差，产物杂、附加值不高等缺陷；生物酶解一般只需在常压、中温条件下进行，加上酶解技术的高效、专一等特性使酶解技术更具有操作性，是生产小分子肽的一种非常有潜力的技术[6]，但单一酶的水解度不高、酶解效率低、水解产物较为粗放。姜红等[7]选用木瓜蛋白酶对天山马鹿茸血进行水解制备免疫活性肽，在52℃、pH7.2、酶用量8U/g、底物浓度为10%时，水解度达到最大为18.1%。周娟娟等[8]选用碱性蛋白酶对鸭血进行单酶水解，在温度50℃、酶用量8000U/g底物、底物浓度7%、pH值为10，酶水解2h时水解度达到最大，但仍小于16%。

目前，越来越多的研究集中于将两个或多个作用条件相近的酶解过程耦合起来，即同步酶解，多种酶同步作用于底物，在增强酶解效果的同时还能减少酶解时间和能耗。本实验采用同步酶解法水解鸭血血浆蛋白，选择合适的内切和外切蛋白酶，以酶的水解度和苦味肽生成量为指标，通过控制酶解时间、酶解温度、pH值、酶用量等条件，建立血浆蛋白的最佳酶解工艺，提高血浆蛋白的水解度，减少苦味肽生成量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭血血浆蛋白 江西煌上煌集团有限公司。

氢氧化钠、盐酸、甲醛、硫酸、邻苯二甲酸氢钾等(均为国产分析纯)；中性蛋白酶(最适pH6.5～7.5，最适温度45～55℃)、风味蛋白酶(最适pH5.5～7.5，最适温度50～55℃) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KDY-9820凯氏定氮仪 厦门精艺兴业公司；VIS-7200紫外可见分光光度仪 北京普析通用公司；ULTERASETTE screen超滤设备 美国Pall公司；MDRP-50型离心喷雾干燥机 无锡市现代喷雾干燥设备有限公司；Potential / Partical Sizer NICOMP 380/ZLS纳米粒度分析仪 美国PSS公司；SSA-4200比表面积孔径测定仪北京彼奥德电子有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质水解度(DH)的测定[9]

总氮(TN)含量的测定： GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》[10]。

氨基氮(AN)含量的测定：SB/T 10318—1999《氨基氮测定法》[11]。

1.3.2 吸水性测定[12]

准确称取1g 小分子肽，平铺于直径为10cm的培养皿(质量为m1)中，置于恒温恒湿(32℃，RH 90%)的培养箱中，每隔6h时测定一次培养皿的质量，至培养皿的质量不再增加时停止测定，此时培养皿的质量为m2，则样品的吸水性按下式计算：

1.3.3 吸油性测定[13]

准确量取0.3g 小分子肽于10mL离心管中，加3mL油，用玻棒搅拌lmin，静止30min后在2000r/min的条件下离心25min，将未被吸附的油析出，记下游离油的体积(V游离油)，通过总油与未被吸附油的体积之差测定其吸附油的百分率，则吸油性按下式计算：

1.3.4 粒度和Zeta电位测定

采用NICOMP380/ ZLS纳米粒度分析仪测定小分子肽的粒度分布及其Zeta电位。将2g小分子肽溶解于98g水中配制成小分子肽溶液，取3～4mL上机测定。

1.3.5 比表面积测定

采用低温氮吸附方法测定小分子肽的比表面积。样品于烘箱中70～80℃预处理2h以上，使样品水分含量降到5%以下，在SSA-4200比表面积孔径测定仪上进行测定，标准样品为碳黑。

1.3.6 苦味度测定

由5位味觉灵敏的品尝人员适度品尝，对小分子肽苦味度评级，然后进行综合评定，苦味度共分5级：重、较重、较轻、轻、无。

2 结果与分析

2.1 血浆蛋白深度水解条件的响应面分析

蛋白质的酶水解生产小分子肽是增强蛋白质附加值的一种效果方法，蛋白质水解产物的性质由水解程度和产生的肽的结构决定，而水解程度又依赖于蛋白质的性质和所使用酶的特性，同时与水解条件，尤其是 pH值和温度有关。

在本实验中，若采用单一酶水解血浆蛋白，不仅水解度低，同时因生成苦肽而产生苦味，因此将多种蛋白酶复合，进行深度水解，可断开血浆蛋白分子肽链内部的肽键，同时分解苦味肽段，降低苦味。在前期研究中发现中性蛋白酶和风味蛋白酶复合水解鸭血血浆蛋白，效果较好，且其最适水解条件相近，因此考虑同步进行两种蛋白酶的酶解，以提高酶解效率，降低能耗。

同步酶解是一个系统化过程，各因素间关联更为细密，微小的环境变化(如pH值、温度、水解时间等)便会对整个酶解系统造成较大影响，因此采用二次回归正交通用旋转试验设计(三因素、五水平)安排实验，探讨各因素间相互关系及其对水解度和苦味生产量的影响[14-15]。3个因素包括X1(pH值)、X2(温度)、X3(中性蛋白酶和风味蛋白酶作用时间)，所考察的响应值为水解度DH(%)，中性蛋白酶和风味蛋白酶用量(E/S)分别为0.3%和0.2%(质量分数)，各因素水平编码见表1。

表1 响应面分析试验因素水平编码表Table1 Variables and levels in the quadratic orthogonal rotation combination design

采用SAS 软件(V9.0)对实验结果进行响应面分析，建立数学模型，并应用脊岭分析优化工艺参数，应用MATLAB 7.0 进行直观作图分析[16]。

表2 响应面分析试验结果Table 2 Quadratic orthogonal rotation combination design and experimental results of degree of hydrolysis of duck plasma proteins

将表2的结果用SAS软件进行编程计算，通过其响应面回归(RSREG)程序进行数据分析，得出回归模型。

2.2 二次回归模型拟合及方差分析

运用SAS-RSREG程序对20个试验点的响应值进行回归分析，得到回归方程：

对方程进行方差分析，所得结果见表3。

表3 方差及可信度分析Table 3 Variance and confidence analyses for the fitted regression model

由表3可见，模型一次项、二次项及总模型的“Prob＞F”均小于0.01，说明一次项、二次项及总模型与响应值之间的相关性极显著；离回归偏差只有0.488768，说明方程拟合度好；总模型的决定系数(R2值)为0.9751，表明理论上该模型可以反映响应值的97.51%。总体上讲，表3的结果表明该模型的拟合度较好。3个因素对水解度的影响强弱顺序依次是X1＞X3＞X2，即pH值＞酶解时间＞温度。

2.3 响应面直观分析

图1 pH值与温度对水解度影响的响应面图Fig.1 Response surface plot indicating the interactive effects of pH and hydrolysis temperature on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

图2 温度与时间对水解度影响的响应面图Fig.2 Response surface plot indicating the interactive effects of hydrolysis temperature and time on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

图3 pH值与时间对水解度影响的响应面图Fig.3 Response surface plot indicating the interactive effects of pH and hydrolysis time on degree of hydrolysis of duck plasma proteins

运用Matlab软件对二次回归模型进行规范分析，作出相应曲面图，结果如图1～3所示。从图中可以直观地了解各因素对水解度的影响以及各因素之间的交互作用，随着温度和pH值的增加，水解度先增大后减小，而随着酶解时间的增加，水解度一直呈上升趋势。采用SAS脊岭分析实验结果进行寻优，结果表明，X1、X2和 X3理论上分别取7.078200、50.457189和4.810755时可以得到理论最大水解度26.017475%。即最佳酶解工艺参数为：pH7.1，反应温度50.5℃，酶解时间4.8h。

2.4 最优条件的验证实验

表4 响应面设计验证实验结果Table 4 The result of validation test

以最佳工艺参数条件做3次平行验证实验，结果如表4所示，实际值与预测值相差不大，3次实验的相对误差均在0.33%以内，说明回归方程能够真实的反应各因素对水解度的影响。

2.5 小分子血肽理化性质测定与分析

将最佳酶解条件所得酶解液进行超滤(ULTERASETTE screen超滤系统，超滤膜截留分子量为3000D，操作压力为28psi，处理时间为40min)、喷雾干燥(离心喷雾干燥机，进风温度为195～200℃，进料速度为29.0～30.0mL/min，出风温度为90～95℃)得到浅黄色血肽粉，无异味，苦味度轻；检测血肽部分理化性质，结果显示平均粒径为798.5nm，比表面为0.82634m2/g，Zeta 电位为－8.63mV，吸水性为0.4388 g/g，吸油性为8.323mL/g。

图4 内切蛋白酶和外切肽酶水解蛋白质示意图Fig.4 Flowchart for protein hydrolysis with endoprotease followed by exoprotease

采用蛋白酶水解血浆蛋白，蛋白质降解变成小肽和氨基酸后，味道更为鲜美，同时也产生苦味。中性蛋白酶属内切蛋白酶，一般作用于分子肽链内部的肽键，断开肽链，水解至中等程度时，末端为疏水性氨基酸的肽产生苦味，即生成了苦味肽，此时进一步用风味蛋白酶(包含外切肽酶)水解，可将苦味肽段分解，既脱除水解液的苦味，增进和改善了水解液的风味，同时增大了蛋白的水解度[17]，如图4所示。本实验通过中性蛋白酶和风味蛋白酶同步酶解鸭血血浆蛋白，产物水解度高，苦味少，同时降低生产能耗，缩短了酶解时间，对其他动物血液酶解制备小分子肽也具有一定借鉴意义。

3 结 论

本实验采用二次回归通用旋转正交设计，通过SAS软件进行相应面分析，建立了中性蛋白酶、风味蛋白酶同步酶解工艺中pH值、水解温度、水解时间对水解度的数学模型。通过相关方差和可信度分析表明，模型拟合度较好。运用SAS的脊岭分析优化中性蛋白酶和风味蛋白酶的同步酶解参数：pH7.1，反应温度50.5℃，酶解时间4.8h。验证结果表明，预测值与实际情况相差不大。经理化指标测定，小分子血肽成品无异味，苦味轻，平均粒径为798.5nm，比表面为0.82634m2/g，Zeta电位为－8.63mV，吸水性为0.4388g/g，吸油性为8.323mL/g。

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Optimization of Bi-enzymatic Hydrolysis of Duck Plasma Proteins for Production of Small Peptides

LIU Cheng-mei1,2，WU Bei1，ZHONG Ye-jun1,2，LIU Wei1，YANG Shui-bing1，YIN Man1
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Engineering Research Center of Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TS201.1；TS251.93

A

1002-6630(2010)10-0151-04

2009-12-22

刘成梅(1964—)，男，教授，博士，研究方向为食品科学。E-mail：chengmeiliu@yahoo.com.cn