结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

赵 勇，师长宏，张彩勤，毛峰峰，白 冰，伍 静，张 海

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响

赵 勇，师长宏，张彩勤，毛峰峰，白 冰，伍 静，张 海

(第四军医大学实验动物中心，西安 710032)

目的 研究结核分枝杆菌(MTB)ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬功能的影响。方法H37Rv菌株感染小鼠巨噬细胞后加入纯化的重组ESAT6-CFP10融合蛋白，通过透射电镜检测自噬体的形成。提取细胞总RNA和蛋白，以实时定量RT-PCR及Western blot方法检测自噬相关基因(atg)分子水平和蛋白表达水平。结果 ESAT6-CFP10融合蛋白可抑制小鼠巨噬细胞自噬体的形成，并导致atg分子表达水平下降，其中atg8表达量下降最为明显。结论 MTB ESAT6-CFP10融合蛋白通过调控atg分子表达水平影响小鼠巨噬细胞自噬功能。

结核分枝杆菌;ESAT6-CFP10融合蛋白;自噬;自噬相关基因(atg)

自噬是巨噬细胞执行免疫防御的重要手段，通过自噬，入侵的病原微生物可被巨噬细胞杀灭［1］。研究发现自噬也是抵抗结核分枝杆菌(MTB)入侵的重要手段［2］，MTB入侵后被巨噬细胞内吞，在自噬相关基因(Atg)的调控下，来源于高尔基复合体、线粒体等细胞器蛋白成分组成新的膜性结构将MTB包裹，形成自噬体结构。自噬体形成后可与溶酶体融合，并借助于溶酶体酸性环境降解入侵的MTB，从而达到免疫防御的目的［3］。但在 MTB的致病过程中，MTB也会通过自身分泌的抗原影响自噬的形成，从而逃避巨噬细胞的免疫杀伤作用。ESAT6和CFP10蛋白是 MTB重要的毒力因子，参与MTB的致病过程，为了研究该蛋白对自噬形成的影响，本文检测ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬形成及相关基因的表达情况，以了解该融合蛋白在MTB致病机理中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:BALB/c小鼠，18～22 g，由第四军医大学实验动物中心提供［SCXK(陕)2008-002］。

1.1.2 试剂及菌株:RPMI 1640培养液、胎牛血清购自于 Gibco公司。RNA提取、RT-PCR试剂盒、RIPA裂解液购自于杭州天根生物科技公司。βactin抗体、IL-2及Syber Green实时定量试剂盒由西安舟鼎国公司提供。7H10培养基购自于 Becton Dicksion公司。小鼠淋巴细胞分离液由天津灏洋公司提供。MTB H37Rv菌株由本室保存。抗atg5多克隆抗体［4］及抗 atg8单克隆抗体由本室制备并保存。

1.2 方法

1.2.1 小鼠巨噬细胞分离、培养:颈椎脱臼法处死小鼠，无菌取出脾脏，研磨后按1∶2比例加入淋巴细胞分离液，4000 r/min离心20 min，吸取中间白膜层，Hank’s液洗脱3次，沉淀以含 10%FCS RPMI 1640培养液悬浮，加入6孔板，37℃ 5%CO2常规培养2 d，弃去悬浮细胞，贴壁细胞即为巨噬细胞。每孔中加入100 U IL-2刺激巨噬细胞增殖。

1.2.2 自噬体检测:巨噬细胞培养至对数生长期后按 MOI=1∶10比例加入1×106CFU的 H37Rv菌株作用2 h，再加入25 μg/mL纯化的 ESAT6-CFP10重组蛋白作用3 h，PBS缓冲液(pH7.4)洗脱三次以洗脱未结合的菌株。对照组细胞只加入等量H37Rv作用2 h。上述细胞以0.25%胰酶消化后收集细胞，20%锇酸固定过夜，透射电镜观察自噬体的形成。

1.2.3 实时定量PCR检测atg mRNA表达水平:根据 GenBank报道的 atg基因序列，分别设计 atg5、atg7、atg8、atg12特异性引物用于实时定量 PCR检测。atg5 上游引物为 5′atgacagatgacaaagatg 3′，下游引物为 5′ctcataaccttctgaaagtg 3′;atg7 上游引物为 5′atgggggaccctggactgg 3′，下游引物为 5′gcagagtcaccatt gtag 3′;atg8 上游引物为 5′tcggagaagaccttcaag 3′，下游引物为 5′catgttgacatggtcagg 3′;atg12 上游引物为5′atgtcggaagattcagagg 3′，下游引物为 5′tttcttggtgtctcc gggag 3′。上述各组细胞收集后加入1mL TRIzol提取细胞总RNA并进行cDNA第一链合成。以cDNA为模板，加入 25 μL Syber Green进行 PCR反应，PCR反应条件为:94℃预变性2 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共进行30个循环。atg mRNA相对定量通过下列公式计算［5］:atg mRNA=2-△ct× 100。

1.2.4 Western blot检测 atg5、atg8蛋白表达水平:收集细胞以RIPA裂解液提取细胞总蛋白。蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳，将适当大小的已预先处理的PVDF膜与PAGE胶相贴，在恒压100 V条件下转移电泳1 h，50 g/L脱脂奶封闭后，分别加入1:50稀释的鼠抗atg5多克隆抗体及atg8单克隆抗体，同时以 β-actin作为内参对照，4℃ 过夜，1 g/L Tween-20 PBS洗涤后，加入HRP标记羊抗鼠IgG抗体，37℃放置1 h。PBS洗涤后，加入底物液显色。

2 结果

2.1 自噬体检测

透射电镜结果发现实验组和对照组细胞均可观察到自噬体典型形态，但在ESAT6-CFP10融合蛋白作用下，巨噬细胞中自噬体形成数目明显减少，而对照组细胞中自噬体数目较多(图1)，表明ESAT6-CFP10融合蛋白会对自噬体形成产生一定的影响。

2.2 atg mRNA表达水平

对照组细胞中 atg5、atg7、atg8、atg12表达水均高于实验组，在 ESAT6-CFP10融合蛋白作用下 atg分子mRNA表达均下调，其中尤以atg8分子mRNA表达水平下降最为明显(图2)。

2.3 atg5、atg8蛋白表达水平

分别以抗atg5多克隆抗体及atg8单克隆抗体与感染细胞总蛋白进行反应，Western blot结果表明这两种分子蛋白表达水平下降(图3)，表明ESAT6-CFP10融合蛋白通过影响atg分子蛋白表达水平调控自噬体的形成。

3 讨论

自噬是细胞通过单层或双层膜包裹待降解物形成自噬体(autophagosome)，然后运送到溶酶体形成自噬溶酶体并进行多种酶的消化及降解，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新［6］。自噬体及自噬现象的研究发现，自噬作用参与了机体对病原体入侵的免疫防御过程，是机体抵御病原入侵的重要防线。自噬在细胞防御中的作用之一就是清除入侵的病原体.尽管侵入细胞的细菌一般通过内吞被运送到溶酶体降解，但还是有一些病原体可以通过阻碍或改变吞噬体的成熟而逃脱宿主的防御机制。细菌在逃脱非吞噬细胞的内吞体后可以被自噬体内化、降解从而减少了细胞内具有复制能力的病原体。因此，自噬能够保护机体免受细菌的侵袭。然而，还有一些细菌可以利用自噬这种机制进行复制。这些细菌经内吞进入细胞后并不通过吞噬作用被清除而是进入了具有自噬体特征的双层膜结构内，它们将自己隐蔽其中并破坏自噬途径。近年来，越来越多的研究表明，自噬在抗胞内细菌和病毒感染中发挥着天然免疫应答的作用:一方面自噬促进机体对胞内感染病原体的清除;另一方面，胞内感染病原体通过某些机制逃避机体的自噬［7］。在自噬体的形成过程中，一些自噬相关基因(autophagy related gene，atg)的表达，如 atg5、atg7、atg8、atg12等，对自噬的形成至关重要，其中 atg8分子表达的LC3蛋白是自噬形成的标志物［8］。

图1 ESAT6-CFP10融合蛋白对自噬体形成的影响Fig.1 The effects on the formation of autophagy by ESAT6-CFP10 fusion protein

图2 atg分子mRNA实时定量RT-PCR结果Fig.2 mRNA expression of of atg by real time RT-PCR

图3 Western blot检测 atg5，atg8分子表达水平Fig.3 Expression of atg5 and atg8 detected by Western blot

通过电镜观察自噬体的形成是研究自噬功能的重要手段，但在前期的研究中我们发现细菌感染巨噬细胞后可很快导致巨噬细胞发生凋亡，感染后4 h即可观察到凋亡的发生，随着作用时间的延长，细胞发生凋亡的程度越高。当凋亡发生时，电镜下只能观察凋亡形成的一些典型形态，而不能观察到自噬体形成。此外，细菌感染巨噬细胞后2～3 h即可被巨噬细胞吞噬，因此基于以上考虑本研究将H37Rv毒株感染巨噬细胞时间控制在2 h，这样既能观察到自噬体的形成，又可保证细菌能被巨噬细胞吞噬。

致病性的MTB能在巨噬细胞中长期存活甚至大量繁殖，且在MTB的繁殖期伴有巨噬细胞大量地以坏死为主的死亡;而非致病性的MTB在感染巨噬细胞后能很快地被巨噬细胞所杀灭，同时伴随巨噬细胞的大量凋亡。这提示我们毒力因子参与了对抗机体的防御机制，可能会通过抑制自噬途径影响巨噬细胞的功能。研究发现MTB表达的ManLAM、pknG等毒力因子能阻断吞噬体－溶酶体的融合过程［9］，而esat6/cfp10也是 RD1区重要的毒力基因，因此它们可能是MTB逃避机体免疫防御的重要因素。pknG与esat6有许多相似之处:①它们都是毒力因子，在无毒株中缺失，而只在毒株中表达;②都是早期分泌蛋白，且无前导信号肽序列;③分泌表达受ESX-1/snm型体系调控。esat6/cfp10分泌调控序列Rv3871已经证明了具有阻断吞噬体－溶酶体融合的过程，因此有理由相信ESAT6-CFP10融合蛋白可能也参与了这一过程。此外，Pathak等［10］认为ESAT6蛋白通过TLR2结合到巨噬细胞表面后可抑制干扰素转录调控因子(IRFs)和NF-κB的激活，而NF-κB转录激活与自噬形成密切相关，因此ESAT6抑制NF-κB激活后也会影响自噬体的形成。本研究观察了ESAT6-CFP10融合蛋白对小鼠巨噬细胞自噬体的影响，并初步探讨其影响机制，结果发现该融合蛋白通过影响atg分子表达抑制巨噬细胞自噬体的形成，这可能是ESAT6-CFP10融合蛋白致病机理。

［1］Rich KA，Burkett C，Webster P.Cytoplasmic bacteria can be targets for autophagy［J］.Cell Microbiol，2003，5(7):455－468.

［2］Gutierrez MG，Master SS，Singh SB，et al.Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and Mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages［J］.Cell，2004，119(6):753－766.

［3］Leemans JC，Thepen T，Weijer S，et al.Macrophages play a dual role during pulmonary tuberculosis in mice［J］.J Infect Dis，2005，191(1):65－74.

［4］赵勇，栗文彬，师长宏，等.自噬相关基因Atg5的原核表达及多克隆抗体制备［J］.生物技术通讯，2009，20(4):482－484.

［5］刘方方，李一荣，陈风花，等.实时定量 PCR检测 TRF1、TRF2和hRAP1基因在急性髓细胞性白血病中mRNA表达［J］.临床血液学杂志，2009，22(8):405－409.

［6］张发仁，许丽艳，沈忠英，等.自噬的概述［J］.汕头大学医学院学报，2005，18(4):250－253.

［7］李宝华，熊思东.自噬对胞内感染病原菌的双重作用［J］.微生物与感染，2006，1(3):181－183.

［8］Marino G，Lopez Otin C.Autophagy:molecular mechanisms，physiological functions and relevance in human pathology［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61(12):1439–1454.

［9］Nguyen L，Pieters J.The Trojan horse: survival tactics of pathogenic mycobacteria in macrophages［J］.Trends Cell Biol，2005，15(5):269－276.

［10］Pathak SK，Basu S，Basu KK，et al.Direct extracellular between the early secreted antigen ESAT－6 of Mycobacterium tuberculosis and TLR2 inhibitsTLR signaling in macrophages［J］.Nat Immunol，2007，8(6):610－618.

The Effects of Mycobacterium tuberculosis ESAT6-CFP10 Fusion Protein on the Function of Autophagy in Mouse Macrophages

ZHAO Yong，SHI Chang-hong，ZHANG Cai-qin，MAO Feng-feng，BAI Bing，WU Jing，ZHANG Hai
(Laboratory Animal Center of Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，China)

Objective To study the effects of Mycobacterium tuberculosis ESAT6-CFP10 fusion protein on the autophagic function of mouse macrophages.Methods Macrophages of mouse were first infected with M.tuberculosis H37Rv，and then infected with ESAT6-CFP10 fusion protein.Transmission electron microscope was used to detect the formation of autophagosome.Total RNA and protein of infected macrophages were extracted and used to measure the expression levels of autophagy-related genes(atgs)by RT-PCR and Western blot.Results ESAT6-CFP10 fusion protein inhibited the formation of autophagosome in mouse macrophages，and the expression level of atgs also reduced，especially the atg8 had a significant reduction.Conclusion ESAT6-CFP10 fusion protein can inhibit the formation of autophagosome in mouse macrophages by the way of down-regulate the expression level of atgs to control the function of autophagy.

Mycobacterium tuberculosis(MTB);ESAT6-CFP10 fusion protein;Autophagy;Autophagy-related genes(atgs)

R379.91+1

A

1671-7856(2010)06-0013-04

2010-01-06

国家自然科学基金资助项目(30872359)。

赵勇(1984－)，男，助理实验师，主要研究方向:感染性动物模型。

张海，男，副教授，主要研究方向:感染性动物模型。