肝纤维化过程中Toll样受体4在肝脏的表达分布及意义

王登妮，徐军全，宋维芳，张晓阳，王明亮，梁永刚，宋彬妤

(1.山西医科大学汾阳学院科技中心，汾阳 032200;2.天津医科大学第二医院病理科，天津 300211)

肝纤维化过程中Toll样受体4在肝脏的表达分布及意义

王登妮1，徐军全1，宋维芳1，张晓阳2，王明亮1，梁永刚1，宋彬妤1

(1.山西医科大学汾阳学院科技中心，汾阳 032200;2.天津医科大学第二医院病理科，天津 300211)

目的 动态观察大鼠肝纤维化过程中Toll样受体4(Toll－like receptor 4，TLR4)蛋白在肝脏的表达，探讨TLR4与肝纤维化发生发展的关系。方法 以四氯化碳皮下注射复制大鼠肝纤维化模型，设立正常对照组和模型1周组、2周组、4周组、6周组。常规HE染色和天狼猩红胶原染色观察肝脏病变;检测肝组织羟脯氨酸和血浆内毒素含量;免疫组化和Western blot检测TLR4在肝组织中的表达，检测α－SMA观察活化的肝星状细胞(HSCs)。结果 与正常对照组比较，CCl4作用2周时，肝组织羟脯氨酸含量开始明显增多(P＜0.01);模型组各组血浆内毒素含量呈梯度上升(P＜0.01)，且与肝组织羟脯氨酸含量呈显著正相关关系(P＜0.01);CCl4作用1周后肝组织TLR4的表达即明显增强(P＜0.01)，4周时和6周时有所下降(与2周组相比，P＜0.05)，但仍高于正常对照组(P＜0.01)。TLR4阳性细胞包括枯否细胞、活化的HSCs及少量的肝细胞和内皮细胞。结论 内毒素及其受体TLR4的改变可能在肝纤维化中起重要作用。

内毒素;内毒素受体;TLR4;肝纤维化

肝纤维化的形成是有多种因素参与的复杂的病理生理过程，其中肠源性内毒素血症(IETM)在肝纤维化发生发展中起重要作用。近几年发现TLR4是介导内毒素脂多糖(LPS)反应的细胞表面特异性受体［1］。LPS与其受体 TLR4结合，激活下游信号转导途径，在机体内产生一系列的免疫应答。目前国内外鲜见在肝纤维化过程中TLR4蛋白在肝组织中动态表达情况的报道，我们本次实验通过动态观察在肝纤维化过程中，TLR4蛋白在肝脏的表达部位以及表达量来探讨其与肝纤维化的关系，为肝纤维化的防治提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 动物及材料

健康清洁级雌性 Wistar大鼠，体重230±20 g，购自山西医科大学实验动物中心［SCXK(晋)2009－0001］;四氯化碳为中国中邦化工分析纯;TLR4一抗、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司;α－SMA免疫组化检测试剂盒购自美国Sigma公司;辣根酶标记山羊抗兔IgG购自北京中杉生物技术有限公司;鲎试剂盒购自上海伊华医学科技公司，天狼猩红、固绿FCF、羟脯氨酸(Hyp)标准品购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 分组:40只Wistar大鼠，在控光鼠房中分笼饲养，温度18℃ ～25℃，湿度45%，食用标准饲料，一周后，随机分为5组，A组(正常对照组)、B组(模型组1周)、C组(模型组2周)、D组(模型组4周)、E组(模型组6周)。

1.2.2 造模:A组给予皮下注射生理盐水，每周两次，其余各组给予首剂5mL/kg体重皮下注射CCl4分析纯，之后按3mL/kg体重皮下注射40%CCl4植物油(v/v)混合液，每周2次。

1.2.3 取材:在无菌无热源条件下，从大鼠腹主动脉采血，注入加有肝素的无热源玻璃试管中，离心取血浆置于玻璃试管中封口，低温保存。取新鲜肝左叶一部分立即固定于4%多聚甲醛，24 h内进行脱水、透明、石蜡包埋;一部分于－80℃保存。

1.2.4 HE染色:对肝组织石蜡切片进行常规 HE染色，观察肝脏病变。

1.2.5 天狼猩红胶原染色:组织切片用天狼猩红染液(0.1%苦味酸天狼猩红染液:Sirius Red 100 mg、Fast Green 50 mg、苦味酸饱和水溶液100mL)室温60 min，中性树胶封片，显微镜观察肝脏胶原染色，红色为胶原纤维。

1.2.6 肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量测定:取冻存肝组织约0.2 g消化 ，取肝脏消化液1.0mL，对照管为1.0mL去离子水，然后依次加入:(1)0.1 mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)0.5mL和0.05 mol/L氯胺T溶液1.0mL，37℃水浴25 min;(2)3.15 mol/L过氯酸溶液1.0mL，室温下作用5 min;(3)10%对二甲氨基苯甲醛溶液1.0mL，100℃沸水5 min;(4)冰浴冷却，测定A560 nm处吸光度。制备标准曲线，利用Hyp标准曲线求得待测肝组织Hyp含量。

1.2.7 产色基质偶氮法鲎试剂测定血浆内毒素:参照试剂盒说明书操作。

1.2.8 免疫组化检测 TLR4、α－SMA:参照试剂盒说明书操作，DAB显色，TLR4以胞膜和胞质棕黄色染色为阳性，α－SMA以胞质棕黄色染色为阳性。

1.2.9 Western blot检测 TLR4:每0.1 g冻存肝组织加入 1mL 裂解液(50mmol/L Tris－HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，1%TritonX－100，100 μg/mL PMSF)裂解0.5 h，在冰浴中进行匀浆。BCA法蛋白定量。5%积层胶和10%分离胶电泳后转移到硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉的PBST室温封闭后，加入兔抗鼠 TLR4多克隆抗体4℃孵育过夜，PBST洗后，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG室温孵育2 h，化学发光检测。采用凝胶成像分析系统计算目的条带的积分光密度、根据目的条带的值与内参照β－actin的值之比行定量分析。

1.3 统计学处理

数据均采用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析。行单因素方差分析(One－Way ANOVA)，SNK(q检验)进行两两比较、spearman相关分析，数据以均数±标准差表示。

2 结果(图1～3见彩插1)

2.1 一般情况及造模效果

实验过程中，正常对照组大鼠健康状况良好，肝脏表面光滑，颜色红润;模型组大鼠的活动及摄食减少，精神萎靡，体重下降，皮毛杂乱无光泽，肝脏表面欠光滑，颜色灰暗，体积变大，边缘圆钝。模型组2周时肝组织Hyp含量开始明显升高，6周时升高更为显著(表1);病理切片观察有较多纤维形成(图1，B;图2，B)，证明肝纤维化模型形成。

2.2 HE和胶原染色

正常组肝小叶结构未见异常，肝细胞索排列规则有序，沿肝窦呈放射状排列，未见变性、坏死及炎细胞浸润，仅在汇管区和中央静脉有少量胶原纤维;模型组肝小叶结构破坏，汇管区有大量炎细胞浸润，纤维增生明显加重，纤维宽窄不一，呈星芒状向肝小叶内延伸(图1、2)。

2.3 血浆内毒素的变化

模型组各时期血浆内毒素含量均高于正常对照组，随CCl4作用时间的延长内毒素呈梯度上升(表1)。

表1 各组大鼠血浆ET，肝组织TLR4、Hyp的变化Tab.1 Changes of plasma ET，liver TLR4，Hyp in each group

2.4 α-SMA和 TLR4免疫组化染色

正常对照组肝组织有微弱TLR4表达;模型组肝组织TLR4表达明显增加，用连续切片做 α－SMA和TLR4免疫组化发现 α－SMA阳性细胞同时表达TLR4蛋白，提示活化的肝星状细胞(HSCs)表达TLR4，TLR4阳性细胞包括枯否细胞、活化的 HSCs及少量的肝细胞和内皮细胞等(图3)。

2.5 Western blot结果

在正常对照组肝组织有少量TLR4表达，肝纤维化过程中TLR4的表达从CCl4作用1周时开始升高，2周时达到高峰，4、6周时有所下降(与2周组比较，P＜0.05)，但与正常对照组相比仍显著升高(P ＜0.01)(图4，表1)。

2.6 相关性分析

肝纤维化过程中血浆内毒素(ET)含量与肝组织Hyp含量呈显著正相关关系(r=0.91，P＜0.01)(图5)。

图4 Western blot检测各组TLR4蛋白的表达水平Fig.4 Western blot was used to analyze TLR4 protein expression in each group

图5 CCl4诱发大鼠肝纤维化过程中血浆内毒素与肝组织Hyp的相关性Fig.5 The relevance of plasma endotoxin and Hyp in liver tissues during the CCl4induced rat liver fibrosis

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段，是肝脏受到慢性损伤时，肝脏细胞外基质分泌与降解失衡，从而在肝细胞的间隙可逆性沉积的结果。在此过程中，有多种细胞，大量的炎症介质细胞因子及生物活性物质共同参与，形成极为复杂的病理生理学过程，其中，内毒素的作用是当前的研究热点之一。

大量临床和实验研究结果表明，急慢性肝病发生发展中常伴有肠源性内毒素血症(IETM)，肝病时，内毒素吸收增多是内毒素血症的主要机制之一，而IETM一旦发生，又进一步造成继发性肝损伤［2，3］。IETM 持续存在，不仅可使急性肝炎慢性化、还有加剧肝纤维化和抑制纤维重吸收的作用，使肝硬变进一步加重［4］。我们的实验结果显示，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化过程中，腹主动脉血血浆内毒素含量在纤维化形成的早期就明显升高，且在纤维化全过程中逐渐升高，6周时约是对照组的7倍，而且血浆内毒素含量变化与肝组织中Hyp含量呈显著正相关。Hyp是胶原蛋白特有的氨基酸，肝组织Hyp含量可反映肝纤维化程度。本实验结果也再次表明内毒素血症与肝纤维化发生发展有密切关系。

虽然内毒素血症可促进肝纤维化发生发展已日渐明确，但内毒素如何通过信号转导系统导致此效应的机制仍不清楚。目前已知，LPS进入宿主血液后与宿主的LBP结合，后者将LPS传递给CD14分子，由CD14介导LPS细胞内传导，但CD14分子是一种GPI膜锚定蛋白，缺乏跨膜区和胞内结构，不能直接向细胞内传导LPS信号，尚需其它分子起信号传导作用。研究发现TLR4可能是LPS信号向细胞内传导的门户蛋白［5，6］。提示，TLR4 在对 LPS 的生物学应答中起关键作用。由此，我们推测 TLR4也可能在内毒素血症促进肝纤维化发生发展中起重要作用。至今鲜见在肝纤维化过程中TLR4蛋白在肝组织中动态表达情况的报道。我们通过CCl4诱导大鼠肝纤维化动物模型初步动态观察了TLR4蛋白在肝脏的表达分布情况。

在我们的实验中，Western blot结果显示，正常大鼠肝组织有少量TLR4蛋白表达，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化发生发展过程中，血浆内毒素含量呈梯度性上升，而TLR4在第1周就开始有明显的升高，2周达到高峰，达正常对照组的6倍之多，4周和6周有所下降，但仍达对照组的4倍多。表明，在CCl4诱导的大鼠肝纤维化过程中，不仅有IETM的发生，同时亦有内毒素受体TLR4蛋白的高表达，但是TLR4的高表达似乎并非简单的由内毒素所致的受体上调效应，可能还有其他的一些因素导致TLR4蛋白在肝脏的高表达，4周和6周有所下降，可能与受体下调效应有关，也可能有“内毒素耐受”机制的参与［7］，具体机制尚有待进一步研究。

TLR4作为LPS的信号传导分子广泛存在于单核、巨噬细胞系统中。我们的免疫组化结果显示:正常对照组大鼠肝组织，在枯否细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞及一些肝细胞有微弱TLR4表达;在纤维化肝组织中TLR4阳性细胞明显增多，强阳性细胞主要是分布在肝窦周围的枯否细胞和活化的HSCs，部分肝细胞、肝窦内皮细胞和胆管上皮细胞的膜上TLR4的表达也有所增强。采用连续切片发现，一些α－SMA阳性细胞同时也表达TLR4，进一步证实了活化的 HSCs也表达 TLR4。目前认为HSCs是纤维化反应的主要效应细胞［8］，而且 HSCs的激活与内毒素有关［9］，传统上认为LPS通过对枯否细胞和单核/巨噬细胞的刺激，导致一些炎症介质的释放，并进而激活HSCs转化为肌纤维样细胞表达α－SMA，使细胞外基质合成增加，降解减少，形成肝纤维化［10］，因此认为 HSCs的激活是一种间接途径。我们的实验结果说明内毒素也可以通过相关受体直接作用于肝星状细胞，进而在肝纤维化的发生发展过程中起重要作用。

综合我们的实验结果表明，在肝纤维化形成早期，不仅血浆内毒素明显升高，而且肝脏实质细胞及非实质细胞膜上的TLR4蛋白表达亦迅速增加，因此血浆内毒素有可能通过上调TLR4来在肝纤维化中发挥作用。

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Expression，Distribution and Significance of TLR4 in the Liver in the Development of Hepatic Fibrosis

WANG Deng－ni1，XU Jun－quan1，SONG Wei－fang1，ZHANG Xiao－yang2，WANG Ming－liang1，LIANG Yong－gang1，SONG Bing－yu1
(1.Science and Technology Center，Fenyang College of Shanxi Medical University，Fenyang 032200，China;2.Department of Pathology，Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211，China)

Objective To observe the dynamic expression patterns of TLR4 protein in the rat liver with chronic fibrogenesis，and to explore the relationship of TLR4 expression with the pathogenesis of hepatic fibrosis.Methods A model of hepatic fibrosis was established using carbon tetrachloride subcutaneous injections in rats.The rats were designed to normal control group and four model groups(1 week，2 week，4 week，6 week).Liver tissue slides were stained with HE and sirius red to study the pathological changes in the livers.Hydroxyproline in liver tissues was measured，and plasma level of endotoxin was measured.Immunohistochemistry and Western blot were used to analyze the expression of TLR4 protein.The α－SMA was determined to observe the activation of HSCs.Results Compared with normal control group，hydroxyproline in liver tissues increased significantly from 2 week(P＜0.01).Plasma level of endotoxin increased significantly in each group(P＜0.01)，and there was significant positive correlation with hydroxyproline of liver(P＜0.01).The expression of TLR4 protein began to increase significantly from 1 week(P ＜0.01)，and to decline at 4 weekand 6 week(compared with 2 week，P＜0.05)，but still higher than the normal control group(P＜0.01).The location of TLR4 protein was found in kupffer cells，activated hepatic stellate cells，a few hepatic cells and endothelium cells.Conclusion Endotoxin and its receptor TLR4 might plays an important role in the liver fibrosis induced by CCl4 induced.

Endotoxin;Endotoxin receptor;Toll－like receptor－4;Hepatic fibrosis

R363

A

1671－7856(2010)06－0017－04

2010－01－14

图1 肝组织病理学图片（HE×100）
注：A：正常对照组，肝小叶结构未见异常；B：模型组，肝小叶结构破坏，汇管区有大量炎细胞浸润。
Fig.1 Histopathology pictures of liver（HE×100）
Note: A: Normal control group， hepatic lobule structure Was normal; B: Model group， hepatic lobule structure Was destroyed， a large number of inflammatory cell could be seen next to portal septa.

图2 肝组织胶原染色，红色为胶原纤维 (×40)
注：A：正常对照组，中央静脉和汇管区有少量胶原纤维；B：模型组，胶原纤维明显增多。
Fig.2 Collagen staining in liver tissue，red for collagen fibers (×40)
Note: A: Normal control group， a small amount of collagen fibers could be seen next to portal septa and central veins; B: Model group，collagen fibers increased significantly.

图3 兔疫组织化学染色 (×100)
注：A和B为TLR4兔疫组织化学染色，A：肝组织有微弱的TLR4表达；B：肝组织TLR4的表达明显增强；C：为α-SMA兔疫组织化学染色，有多量α-SMA阳性肝星状细胞。
Fig.3 Immunohistochemistry staining （×100)
Note：A and B respectively represented TLR4 immunohistochemistry staining of normal control group and model group， A: Rats in normal group， TLR4 protein expressed Weakly in liver tissues; B: The expression of TLR4 began to increase significantly; C represented α-SMA immunohistochemical staining of model group，had a amount of α-SMA positive hepatic stellate cells.

山西省回国留学人员科研资助项目(NO.2002－74)。

王登妮(1978－)，女，硕士，助教。E－mail:dengni99@126.com

徐军全，男，硕士生导师。E－mail:xujq@sina.com