D－半乳糖建造老年性聋动物模型

陈十燕，陈贤明，，罗 萍，肖 丽

(1.福建医科大学福州总医院临床医学院，福州 350025;2.南京军区福州总医院耳鼻咽喉－头颈外科，福州 350025)

D－半乳糖建造老年性聋动物模型

陈十燕1，陈贤明1，2，罗 萍2，肖 丽2

(1.福建医科大学福州总医院临床医学院，福州 350025;2.南京军区福州总医院耳鼻咽喉－头颈外科，福州 350025)

目的 研究D－半乳糖建造老年性聋模型的理想方式。方法 健康wistar大鼠50只，随机分为5组，即对照组和四个不同剂量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)建造的老年性聋模型组。观察各组动物行为检测(兴奋性实验)、ABR反应阈、血清中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性、听皮层中的神经元形态和数量。结果 各模型组较对照组探究能力明显下降，但紧张度无明显改变。血清中MDA含量和SOD活性与对照组比较有显著性升高(P＜0.05)，但 ABR阈值和Ⅰ、Ⅲ波潜伏期仅500 mg/kg组显著升高延长，其他模型组与对照组均无显著性差异。并且模型组中仅500 mg/kg组听皮层出现明显的神经细胞稀少、肿胀，尼氏小体减少的现象。结论 D－半乳糖(500 mg/kg)腹腔注射每天一次持续10周造模是建造老年性聋动物模型的有效方法。

wistar大鼠;老年性聋;D－半乳糖;模型，动物

老年性聋是指因年龄的增长，听觉器官随同身体其他组织器官一起所发生的缓慢进行性老化过程，并出现听力减退的生理现象。它是自然老化过程，听力损失以高频为主。在老年性聋的实验研究中，国内外多是采用经临床证实的人类老年性聋患者及自然衰老的动物，以老年性聋模型作为研究对象并不多见。用人类老年性聋患者和自然衰老的动物作为实验对象具有一定的局限性，一是研究对象不容易获取，而且样本量收集的时间较长。二是在病理方面研究其发展变化用人类老年性聋患者是不可行的，所以制备老年性聋动物模型是很有必要的。国内有多家学者提出D－半乳糖构建老年性聋动物模型，但其动物的选取、给药的方式、剂量和时间有很大差异。本实验通过不同剂量D－半乳糖建造老年性聋模型并对该造模条件进行比较，为老年性聋的研究提供一个可靠、简便易行的实验动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

选用耳廓反射灵敏的健康Wistar大鼠(月龄2～3个月)50只，体重180～200 g，由上海斯莱克实验动物公司提供［SCXK(沪)2007－0005］。D－半乳糖购于Sanland公司。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。甲苯胺蓝购于 Amresco公司。50只大鼠随机分为5组，每组10只，即对照组和四个不同剂量D－半乳糖(50、100、200、500 mg/kg)腹腔注射建造的老年性聋模型组。对照组(甲组)腹腔注射等体积的生理盐水作为对照，模型组(4种剂量分别为 MG1，MG2，MG3和MG4)每天一次，持续10周。

1.2 观察指标

1.2.1 兴奋性实验［1］:利用旷场实验分析。观察小鼠在5 min内跨格次数、站立次数、排便粒数和小便的次数。跨格次数和扶墙站立次数反映兴奋性，排便粒数和小便次数反映紧张反射情况。

1.2.2 ABR反应阈检测:美国intelligent hearing听觉诱发电位系统进行测试。1%戊巴比妥钠按40 mg/kg行腹腔注射麻醉，待麻醉满意后在具有良好隔音室内(环境温度25℃ ±3℃)。耳塞置于外耳道内。用针灸银针作电极，将电极分别置入颅顶及双侧乳突皮下深达骨膜，颅顶为记录电极，参考电极在测试耳乳突部，对侧耳乳突部为接地电极。刺激参数:刺激声为时程100 s的方波脉冲短声(click)，带通滤波100～3000 Hz，扫描时程10 ms，扫描平均叠加1024次，增益10000倍，短声刺激重复率为11次/s，刺激强度从90 dB开始，5 dB一档次递减，以Ⅲ波为标志波确定阈值。再以80 dB的刺激强度测试大鼠的各波潜伏期和波间期。取每只大鼠右耳结果进行分析。

1.2.3 血清中的MDA和SOD检测:各组动物在用药前和用药后分别采静脉血2mL，室温下静置30 min，于4℃下3500 r/min离心10 min，取上层血清置－20℃冰箱内储存备测。测试的过程严格按照测试盒上的说明进行操作。分别计算出SOD活力和MDA的浓度。

1.2.4 听皮层石蜡切片:动物麻醉，开胸，经左心室灌注生理盐水，冲净血液，随后用4%多聚甲醛进行心脏灌注，然后开颅解剖定位并取下听皮层，固定后石蜡包埋切片，每张切片的厚度为6 μm，进行甲苯胺蓝染色。观察其神经元的形态和数量。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0等统计软件对资料进行数据分析，数值用(±s表示，五组之间进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 兴奋性实验测试结果

各实验组较对照组其探究活动(爬格数和扶墙次数)明显减少(P＜0.05)，但其紧张度(大小便)无明显变化(P ＞0.05)(表1)。

表1 D－半乳糖各不同剂量兴奋性实验各项指标比较(n=10)Tab.1 Comparison of four excitatory experiment indexes in different groups(n=10)

2.2 血清中MDA和SOD检测结果

MG1、MG2、MG3、MG4 四组 SOD 活性较甲组均有不同程度下降(P＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三组之间差异不显著 (P ＞0.05)。MG4组SOD活性最低，与其余各组相比均有显著性差异(P ＜0.05)。MG1、MG2、MG3、MG4 四组 MDA 较CG组均有不同程度下降(P ＜0.05)。其中 MG1、MG2、MG3三组之间差异不显著 (P ＞0.05)。MG4组MDA最高，与其余各组相比均有显著性差异 (P＜0.05)(表2)。

表2 D－半乳糖各不同剂量组SOD(U/mgprot)活性和MDA(nmol/mgprot)的浓度比较(n=10)Tab.2 Comparison of the activity of SOD and the level of MDA in serum in different groups(n=10)

2.3 ABR检测结果

MG1、MG2、MG3、MG4 四组 ABR 反应阈、Ⅰ、Ⅲ波潜伏期和Ⅰ—Ⅲ波间期较CG组均有不同程度升高和延长，但其CG、MG1、MG2、MG3四组组间差异不显著(P ＞0.05)，MG4组不仅ABR反应阈明显升高，且I、III波潜伏期和波间期较 CG、MG1、MG2、MG3各组差异均有显著性差异 (P＜0.05)(表3)。

2.4 甲苯胺蓝染色结果

光镜下见 CG、MG1、MG2、MG3四组中大鼠听皮层神经细胞密集，染色均匀，尼氏体正常，胞核和胞质极少有皱缩和空泡样变。胶质细胞正常。MG4组中听皮层神经元数明显减少(P＜0.05)，神经细胞肿胀，胞核和胞质浓缩，尼氏体减少(表4，图1，见彩插3)。

表3 D－半乳糖各不同剂量组ABR检测结果比较(n=10)Tab.3 Comparison of the results of ABR detection in different groups(n=10)

表4 D－半乳糖各不同剂量组听皮层神经元数比较(n=10)Tab.4 Comparison of the number of neurons in different groups(n=10)

3 讨论

D－半乳糖致衰老模型是由中国学者［2］在 20世纪80年代末期建立并应用于老年医学研究的，该模型在建立的初期主要是用于老年性白内障的研究，在后续的研究中越来越多的证据表明，D－半乳糖的致代谢紊乱作用不仅作用于眼晶体，其他部位如视网膜、肝、脑、耳等组织也会出现一系列的退行性改变。国内已有学者提出以D－半乳糖诱导豚鼠发生衰老，可以在内耳产生老年性聋的病理改变［3］。D－半乳糖在体内可氧化产生大量自由基，使机体抗氧化酶活力下降，过氧化产物累积，还可以造成组织细胞内半乳糖醇堆积，影响正常渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍，代谢紊乱。还有研究发现 D－半乳糖具有降低细胞增殖能力，加速细胞老化作用。最终加速机体衰老，并诱导体内多器官发生衰老性疾病［4］。

老年性聋动物模型动物品种的选择有豚鼠、SD大鼠、Wistar大鼠，给药途径有口服、眼球后、颈部皮下和腹腔注射给药，给药的时间有4周、6周、8周等。在动物品种方面，豚鼠的听觉较 SD大鼠和Wistar大鼠敏感，常用于听力学实验方面的研究，但其饲养成本较高，并由于其听觉的特殊性不宜普遍推广。在给药途径方面，口服是将D－半乳糖混入饲料中每日定时定量喂养，这种方法过于理想化，对实验条件的准确度把握较差。眼球后注射操作方法较为复杂，并容易操成局部损伤，而皮下注射方法较为简单，但易在局部形成肿块不宜吸收。另外，传统的造模方法所需时间只要4～6周，但本实验在传统剂量下(50 mg/kg～100 mg/kg)6周左右并未发现大鼠的听力(ABR反应阈，Ⅰ—Ⅲ波的潜伏期和波间期)有显著性的变化。本实验研究通过对Wistar大鼠在不同剂量D－半乳糖的连续腹腔注射10周后，观察其是否符合老年性聋实验动物模型。实验前后所有大鼠并无因给药而出现死亡、体重异常改变的现象。实验组动物在6～8周时均出现行动迟缓、进食少、体形消瘦、反应差等形体衰老现象。结合兴奋性试验结果分析可知，实验组动物都出现不同程度的衰老变化，但ABR反应阈在此期间并无明显变化。10周后发现实验组中仅500 mg/kg其他各组之间差异有显著性组，出现听力下降(P＜0.05)，并且其血清中的SOD活性和MDA的浓度较其他各实验组之间差异有显著性，而其他实验组之间无显著性差异。结果表明一段时间内连续给药可以使大鼠发生衰老变化，但衰老并不一定就有听力下降的表现，这可能与给药时间长短、给药的剂量存在的关系。实验证实 D－半乳糖500 mg/kg的剂量每日一次是可以被机体接受的，并可以产生显著的听力下降，是切实可行的造模方法。

老年性聋不仅表现为内耳病理形态学改变，听觉中枢神经系统亦可发生退行性变，听觉传导通路和皮层中神经核团内的神经细胞萎缩，数量减少，甚至发生核固缩［5］。本实验在实验组大鼠听皮层观察到其神经元计数明显少于对照组，并且其形态上也发生显著改变，与文献报道的检测一致。有学者［6］在通过比较3月龄和36月龄大鼠发现老年大鼠的听皮层的厚度较成年大鼠减少46%左右，且神经元胞体，树突的结构和形态均有改变。在其他的一些研究中发现18月龄的Wistar大鼠较3月龄的听皮层的细胞凋亡率显著升高，从而造成听皮层的功能减退而出现听力下降［7］。D－半乳糖长期应用可以使机体内产生大量的氧自由基。氧自由基不仅能激活细胞凋亡基因，使细胞发生程序性死亡，而且能直接损伤 DNA，诱导细胞凋亡，同时还能影响核基因转录，改变细胞的表型特征，诱导细胞发生凋亡。SOD则是体内重要的自由基清除剂，是生物体防御活性氧和其他氧自由基伤害的酶［8］。有研究表明由D－半乳糖所造成大鼠氧化损伤的机制与自然衰老大鼠是相一致的，都是通过减低SOD基因转录水平从而导致 SOD蛋白表达水平降低［9］。另外，SOD还与某些凋亡基因有着密切关系。肿瘤坏死因子(TNF)可引起许多肿瘤或非肿瘤细胞的凋亡，TNF可诱导细胞内自由基的产生，细胞内表达的SOD能抑制它所引起的细胞凋亡，当SOD水平下降时，细胞对TNF的敏感性升高，造成细胞的凋亡率上升［10］。在大鼠听皮层、蜗核、耳蜗组织中氧自由基产生增多，同时机体抗氧化防御系统功能下降，产生与清除之间出现显著失衡，发生氧化损伤和诱导细胞发生凋亡，听觉系统细胞受到损害和减少，而导致听觉功能障碍［11］。本实验对 D－半乳糖建立老年性聋模型进行研究，为老年性聋的研究提供－个可靠、简便易行的实验动物模型。

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Model Establishment of Presbycusis by D-galactose

CHEN Shi－yan1，CHEN Xian－ming1，2，LUO Ping2，XIAO Li2
(1.Clinical Medicine School，Fuzhou General Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou 350025，China;2.Department of Otolaryngology－Head and Neck Surgery，Fuzhou General Hospital of PLA，Fuzhou 350025，China)

Objective To find an ideal way for model establishment of presbycusis by D－galactose.Methods Fifty wistar rats were randomly divided into five groups，including one control group(CG)and four model groups(model group 1∶MG1，model group 2∶MG2，model group 3∶MG3 and model group 4∶MG4)with different dosages of D－galoctose(50 mg/kg，100 mg/kg，200 mg/kg，500 mg/kg).Then，we observed in each group the changes in animal behavior(excitatory experiment)，in ABR，and in the activity of SOD and the level of MDA in serum，as well as morphological and quantitative changes in auditory cortex neurons.Results Compared with the control group，no visible changes of tensity were observed，while the ability of exploration obviously decreased，and the activity of SOD and the level of MDA in serum significantly increased(P＜0.05)in the four model groups.However，only in MG4，latency of waveⅠ andⅢ and threshold of ABR were significantly delayed and elevated when compared with the control group.In addition，significant morphological changes in auditory cortex could also be seen in MG4，such as scarcely distributed neurons，swollen bodies of neurons，and reduced number of Niss＇s bodies.Conclusion It is an effective method for the model preparation of presbycusis by intraperitoneally injection of wistar rat by 500 mg/kg D－galactose every day for 10 weeks.

Wistar rat;Presbycusis;D－galactose;Model，animal

R764.436

A

1671－7856(2010)07－0017－04

2010－03－02

图1 甲苯胺蓝染色结果
Fig.1 Results of auditory cortex section stained by toluidine blue
注：a:对照组； b:模型组 2； c: 模型组 4。
Note: a: Control group; b: Model group 2; c: Model group 4.

福建省科技计划重点项目(2009Y0041)。

陈十燕(1985－)，男，硕士生，研究方向:耳聋的基础和临床研究。E－mail:Chenshiyan0207@163.com

陈贤明。E－mail:fzchxming@sina.com