过氧化氢对吗啡依赖的SH－SY5Y细胞内活性氧水平的影响

张玉柯，王振华，张娟，李惠，郑秋生

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002）

过氧化氢对吗啡依赖的SH－SY5Y细胞内活性氧水平的影响

张玉柯，王振华，张娟，李惠，郑秋生

（石河子大学药学院／新疆特种植物药资源教育部重点实验室，石河子832002）

为探讨H2O2对吗啡依赖的人神经母细胞瘤SH－SY5Y细胞内ROS水平的影响，应用H2O2在吗啡依赖的SH－SY5Y细胞建立氧化应激损伤的实验模型，分别利用MTT法测定细胞存活率、Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡和DCFH－DA荧光探针检测细胞内ROS水平。结果表明：100－400μmol／L H2O2处理长期吗啡作用的SH－SY5Y细胞，使细胞的存活率明显降低、凋亡率显著增加，吗啡时间依赖性的诱导SH－SY5Y细胞内产生ROS，H2O2处理吗啡长期作用的SH－SY5Y细胞，使细胞内ROS水平进一步升高；NAC预处理长期吗啡作用的SHSY5Y细胞可阻断吗啡引起SH－SY5Y细胞存活率的降低、细胞凋亡率的增加及细胞内ROS水平的升高，由此可知，NAC能明显保护SH－SY5Y细胞对抗吗啡引起的损伤，降低ROS的水平可能是NAC的细胞保护机制之一。

吗啡依赖；活性氧；N－乙酰－半胱氨酸

阿片类药物广泛用于镇痛，而长时间使用阿片类药物，可导致阿片耐受和依赖［1］，阿片类药物滥用成瘾己成为严重的社会问题。目前对阿片依赖的机制尚未明确。

吗啡依赖的形成与活性氧（reactive oxygen species，ROS）自由基关系密切，氧化应激是吗啡依赖产生和发展的一个重要机制［2］。有研究报道［3］，吗啡可诱导HUVECs细胞产生ROS，纳洛酮预处理吗啡长期作用的HUVECs细胞，可以逆转吗啡引起的HUVECs细胞活力的下降、ROS的产生、线粒体膜电位（MMPs）下降等。阿片类药物的代谢产物可直接参与肾小球膜细胞中过氧化物的产生［4］。抗氧 化 剂 N－乙 酰－半 胱 氨 酸 （N－acetyl cysteine，NAC）能抑制吗啡诱导的肝细胞、巨噬细胞、神经细胞的凋亡［5］。种种迹象都表明，在阿片耐受和依赖的形成过程中，伴随着ROS的产生，ROS能通过氧化作用攻击细胞的生物大分子，从而可能降低细胞内抗氧化酶、非酶抗氧化剂等的活性，使机体清除ROS的能力降低。ROS与吗啡依赖和戒断密切相关。氧化损伤可能是产生吗啡成瘾的重要原因。

本研究采用H2O2作用于长期吗啡作用的SHSY5Y细胞，诱导细胞产生氧化应激，观察其对长期吗啡作用的SH－SY5Y细胞内ROS水平的影响，以及NAC预处理后细胞内ROS水平的变化。初步探讨抗氧化剂在缓解药物成瘾行为中可能存在的作用与意义。

1 材料与方法

1．1 实验材料

SH－SY5Y 细 胞 株；DMEM 培 养 基，Hoechst33258染 液，全 反 式 维 甲 酸 （all－trans－retinoic acid，RA）、NAC、［3－4，5－dimethylthiazol－2－yl］－2，5－diphenyl tetrazolium bromide（MTT），还原型二氯荧光素－二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH－DA）均购自Sigma公司；特级胎牛血清购自杭州四季青生物工程公司；盐酸吗啡注射液（批号TD2006－0119）购自青海制药厂有限公司；盐酸纳洛酮注射液（批号20023762）购自北京华素制药股份有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

1．2 细胞培养和RA诱导细胞分化

SH－SY5Y细胞用含10%胎牛血清、100U／mL青霉素、100mg／mL链霉素的DMEM 培养基，于37℃、5%CO2条件下培养。10μmol／L RA诱导SH－SY5Y细胞向神经元型分化，增加细胞表面μ－阿片受体的表达，RA 作用6d，隔天换1次液［6－7］，于相差显微镜下观察细胞形态的变化。

1．3 吗啡依赖模型的建立及细胞分组处理

10μmol／L吗啡作用于经RA分化培养的SHSY5Y细胞24h后，PBS润洗细胞，进行纳洛酮（浓度为10μmol／L）急性阻断［8］；吗啡与纳洛酮（浓度均为10μmol／L）共孵育细胞24h，进行纳洛酮慢性阻断。

H2O2诱导长期吗啡作用的SH－SY5Y细胞损伤模型的制备参照文献［9－10］。细胞分组：将长期吗啡作用的SH－SY5Y细胞分为对照组、H2O2组、NAC组及空白对照组。1）对照组：吗啡作用SHSY5Y细胞24h后，进行纳洛酮急（慢）性阻断；2）H2O2组：不同浓度的 H2O2（50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L、300μmol／L）作用于经纳洛酮急（慢）性阻断的SH－SY5Y 细胞4h；3）NAC组：100 μmol／LNAC预处理细胞1h，进行纳洛酮急（慢）性阻断；4）空白对照组：不加任何处理。以上各组最后均置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养。

1．4 MTT法检测细胞活力

采用MTT法测定细胞的生长活力［11］。经RA分化的SH－SY5Y细胞接种24h后，不同浓度的H2O2（50μmol／L、100μmol／L、200μmol／L、300 μmol／L、400μmol／L）或者 NAC（100μmol／L、200 μmol／L、300μmol／L、400μmol／L）分别作用 SHSY5Y细胞24h，并置于5%、37℃二氧化碳培养箱内培养。最后每孔加入 MTT溶液10μL（5μg／mL）继续培养4h，经处理后于多功能酶标仪于570 nm（630nm校准）波长下测定各孔吸光度。

存活率＝（OD试验组／OD对照组）×100%。

1．5 细胞凋亡的荧光染色检测

收集经药物处理后的细胞，离心弃上清，加入终浓度为104μg／L的Hoechst33258荧光染液，混匀，37℃孵育10min［12］。最后于荧光显微镜下观察、拍片。

1．6 细胞内的ROS水平测定

10μmol／L吗啡分别作用经RA分化的SHSY5Y细胞10min、2h、4h、12h和24h后，进行纳洛酮急性阻断；不同浓度的 H2O2（50μmol／L、100 μmol／L、200μmol／L、300μmol／L）作用于吗啡长期处理的SH－SY5Y细胞4h；或100μmol／L NAC预处理吗啡急性作用、纳洛酮急／慢性阻断的SHSY5Y细胞1h。收集经上述处理的细胞，加入10 mol／LDCFH－DA，37℃孵育30min，最后测定其荧光强度，激发光为485nm，发射光为525nm［13］。结果以1×105细胞的荧光强度表示。

1．7 数据处理

所有数据用表示，采用SPSS10．0软件包，进行单因素方差分析及t检验。

2 结果

2．1 RA诱导SH－SY5Y细胞分化的形态学观察

倒置显微镜下观察，正常SH－SY5Y细胞胞体大小不均，胞核大，核仁多而明显。经RA诱导分化后，可见细胞核变小且较规则一致，胞体呈圆形或多角形，出现树突状突起，分布成网络，细胞分化特征明显。

2．2 MTT检测细胞活力

如图1所示，H2O2和NAC对细胞活力的影响在一定范围内呈剂量依赖关系。300μmol／L H2O2可以使细胞存活率降低至52．1%±1．2%（图1a）；100μmol／L NAC有较强的自由基清除能力，能显著提高细胞的活力，从而拮抗吗啡诱导的细胞毒性效应（图1b）。

图1 H2O2／NAC对SH－SY5Y细胞活力的影响Fig．1Effects of H2O2／NAC on SH－SY5Ycells survival

2．3 细胞凋亡的荧光染色检测

图2 细胞凋亡的荧光观察Fig．2The determination of morphological apoptosis

如图2所示，正常细胞核的Hoechst着色形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒（图2a）；10μmol／L吗啡作用SH－SY5Y细胞24h后，其核由于浓集而呈亮兰色，出现部分凋亡形态（图2b）；300μmol／L H2O2处理吗啡长期作用的SH－SY5Y细胞4h后，其核呈分叶，碎片状，边集，H2O2进一步诱导了SH－SY5Y细胞的凋亡（图2c）；100μmol／L抗氧化剂NAC预处理吗啡长期作用的SHSY5Y细胞1h后，细胞凋亡形态少见（图2d）。

2．4 细胞内的ROS水平检测

10μmol／L吗啡分别作用于经RA分化的SHSY5Y细胞10min、2h、4h、12h和24h并进行纳洛酮急性阻断，结果见图3。图3显示，细胞内ROS的水平随着吗啡处理时间的延长而升高。在12h时，即可达到一个较高水平，为（0．453±0．013）／105个细胞（图3a）。不同浓度H2O2作用于纳洛酮急／慢性阻断的SH－SY5Y细胞4h后；与未经H2O2处理组比较，ROS的水平随着H2O2处理浓度的升高而升高，150μmol／L H2O2即可产生较高的荧光强度，分别为（0．532±0．015）／105个细胞、（0．343±0．013）／105个细胞（图3b）。NAC（100μmol／L）预处理吗啡急性作用、纳洛酮急／慢性阻断的SHSY5Y细胞1h后，NAC通过清除自由基，使细胞内ROS的含量有所下降（图3c）。与未经吗啡处理组比较，纳洛酮急性阻断组和纳洛酮慢性阻断组：P＜0．01（差异均有统计学意义）；但吗啡急性作用组与对照组比较，无统计学意义。

图3 SH－SY5Y细胞内的ROS水平Fig．3The accumulation of ROS in SH－SY5Ycells

3 讨论

本实验首先从形态学上观察到，吗啡长期作用诱导了SH－SY5Y细胞凋亡。H2O2可进一步诱导吗啡依赖的SH－SY5Y细胞凋亡，使细胞内ROS的水平显著升高；NAC作用于长期吗啡的SH－SY5Y细胞，显著提高了细胞的活力、降低了细胞内ROS的水平，抗氧化剂对长期吗啡的SH－SY5Y细胞有明显的保护作用。

μ－阿片受体在细胞介导信号转导、ROS产生、Caspase级联反应中起重要作用。吗啡长期处理SH－SY5Y细胞，其通过作用于细胞表面的μ－阿片受体诱导细胞内ROS的产生。而ROS作为一种细胞内特殊的信号分子，具有高度的化学活性［14］，通过氧化还原修饰影响细胞信号传导系统，从而诱导了细胞的凋亡。ROS造成的损伤和凋亡是许多疾病发生、发展的重要环节，特别是在阿片耐受、依赖的调控中起重要作用［2－15］。其参与阿片耐受、依赖的可能机制是：ROS作为配体通过激活细胞表面的阿片受体，并与之结合，导致细胞内效应器活性的变化，使得ROS介导的信号转导与吗啡依赖和戒断的受体后信号转导进行信号交流和整合，从而参与到吗啡依赖的机制中，最终可能导致细胞死亡，严重影响了正常的生理功能。抗氧化剂NAC可通过调节细胞氧化还原状态而参与自由基清除活动［16］，从而阻断上述信号转导途径，抑制细胞的凋亡，发挥对神经细胞的保护作用。

目前对于阿片信号与ROS的联系知之甚少。进一步深入研究ROS对阿片耐受和依赖的调节作用，可以为最终阐明阿片耐受和依赖的分子机制提供有力的证据，本实验对二者之间的联系进行了初步探讨，从自由基的角度给治疗阿片依赖和预防复吸提供了新的治疗方案。为抗氧化剂在改善和缓解吗啡戒毒反应、研制镇痛复方等方面的临床应用提供了新思路。

［1］McNicol E，Horowicz M N，Fisk R A，et al．Management of opioid side effects in cancer－related and chronic noncancer pain：a systematic review［J］．Journal of Pain，2003，4（5）：156－231．

［2］Pan J，Zhang Q，Zhang Y T，et al．Oxidative stress in heroin administered mice and natural antioxidants protection［J］．Life Sciences，2005，77：183－193．

［3］Hsiao P N，Chang M C，Cheng W F，et al．Morphine Induces Apoptosis of Human Endothelial Cells through Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species athways［J］．Toxicology，2008，10：1012－1016．

［4］Singhal P C，Pamarthi M，Shah R，et al．Morphine stimulates superoxide formation by glomerular mesangial cells［J］．Inflammation，1994，18：293－299．

［5］Seyedmehdi P，Azadeh B，Amirali H S，et al．Chronic morphine treatment induces oxidant and apoptotic damage in the mice liver［J］．Life Sciences，2006，79：972－980．

［6］Clagett D M，McNeill E M，Muley P D．Role of all－trans retinoic acid in neurite outgrowth and axonal elongation［J］．Neurobiol，2006，66：739－756．

［7］Lionel M，Jérémie N，Sandrine U J，et al．Long－Term Morphine Treatment Enhances Proteasome－Dependent Degradation of Gβin Human Neuroblastoma SH－SY5Y Cells：Correlation with Onset of Adenylate Cyclase Sensitization［J］．Mol Pharmacol，2005，68：467－476．

［8］Elena H C，Maria P，Christine K，et al．Dopamine－dependent increases in phosphorylation of cAMP response element binding protein （CREB）during precipitated morphine withdrawal in primary cultures of rat striatum［J］．Journal of Neurochemistry，2003，87：107－118．

［9］Kanupriya D，Kumar R，Sawhney R C，et al．Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert－butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U－937human macrophages［J］．Mol Cell Biochem，2005，275：1－6．

［10］Zhang L，Yu H X，Sun Y，et al．Protective effects of salidroside on hydrogen peroxide－induced apoptosis in SH－SY5Yhuman neuroblastoma cells［J］．European Journal of Pharmacology，2007，564：18－25．

［11］Kanupriya D，Kumar R，Sawhney R，et al．Cytoprotective and antioxidant activity of Rhodiola imbricata against tert－butyl hydroperoxide induced oxidative injury in U－937human macrophages［J］．Mol Cell Biochem，2005，275：1－6．

［12］Ji Y I，Hyeyoung P，Keon W K，et al．Modulation of cell cycles and apoptosis by apicidin in estrogen receptor（ER）－positive and－negative human breast cancer cells［J］．Chemico－Biological Interactions，2008，172：235－244

［13］Leutner S，Eckert A，Muller W E．ROS generation，lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in the aging brain［J］．Neural Transm，2001，108：955－967．

［14］Lu L S，Ruan Z R，Yue W J，et al．Attenuation of morphine dependence and withdrawal in rats by venlafaxine，a serotonin and noradrenaline reuptake inhibitor［J］．Life Sciences，2001，69（1）：37－46．

［15］Zhou J F，Yan X F，Ruan Z R，et al．Heroin abuse and nitric oxide，oxidation，peroxidation，lipoperoxidation［J］．Biomedecine and Environmental Sciences，2000，13：131－139．

［16］Sevilla D L，Mano A M，Manso M A，et al．N－acetylcysteine prevents intra－acinar oxygen free radical production inpancreatic duct obstruction－induced acute pancreatitis［J］．Biochim Biophys Acta，2003，1639（3）：177－184．

Effect of H2O2on ROS Production in Morphine－Dependent Human Neuroblastoma SH－SY5YCells

ZHANG Yuke，WANG Zhenhua，ZHANG Juan，LI Hui，ZHENG Qiusheng
（School of Pharmacy，Shihezi University／Key Laboratory of Xinjiang Endemic Phytomedicine Resources，Ministry of Education，Shihezi 832002，China）

To explore the effect of hydrogenperoxide（H2O2）on ROS production in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．Morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells were used to set up the oxidative stress injury experiment model by using H2O2．Viability of cells were measured by MTT assay．The apoptotic cells were assessed by Hoechst 33258stain．Levels of ROS in SH－SY5Ycells were assessed by 2’7’－dichlorodihydrofluorescin fluorescence．Results showed that H2O2at 100μmol／L to 400μmol／L reduced the cell viability and increased the apoptotic percentage．Morphine time－dependently resulted in the increase of ROS．H2O2markedly induced the overproduction of ROS in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．However，pretreatment with N－acetyl－cysteine（NAC）markedly attenuated cell viability loss，cells apoptosis and the increase in ROS levels in morphine－dependent human neuroblastoma SH－SY5Ycells．These datas showed that NAC could protect human neuroblastoma SHSY5Ycells against morphine－induced damage，which was associated with the inhibition of the production of ROS induced by morphine．

morphine dependence；reactive oxygen species；N－acetyl－cysteine

R285．5

A

2010－02－26

国家自然科学基金项目（3086154）

张玉柯（1984－）女，硕士生，专业方向为药物制剂。

郑秋生（1963－），男，教授，从事药物制剂的研究；e－mail：kz－shz＠163．com。