中华鳖蛋白质组分的分步提取及其抗氧化活性

刘 彦，刘承初,*，杨靖亚，刘其根，李应森，李家乐,3

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306；3.上海市高校水产养殖学E-研究院，上海 201306)

中华鳖蛋白质组分的分步提取及其抗氧化活性

刘 彦1，刘承初1,*，杨靖亚1，刘其根2，李应森2，李家乐2,3

(1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海海洋大学 省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306；3.上海市高校水产养殖学E-研究院，上海 201306)

以野生中华鳖全鳖粉为原料，采用分步提取法对中华鳖的蛋白类成分进行分离，并利用等电点沉淀、醇沉、超过滤等方法分离纯化出各蛋白质组分，并对其各组分的抗氧化性进行研究，并对抗氧化活性高的组分进行分子质量测定分析；还原力的测定以还原剂BHT为对照，清除DPPH自由基能力的测定则进行直线回归分析并计算 IC50值。结果表明：糖蛋白组分及水溶性蛋白组分抗氧化活性较高，IC50值为0.21mg/mL和1.94mg/mL。因此，中华鳖各蛋白组分有较高的抗氧化能力且呈显著的剂量效应关系，其在抗氧化方面和保健食品方面具有巨大的开发潜力。

中华鳖；分步提取；纯化；氨基酸；抗氧化活性

Abstract：Protein fractions were separated and purifies from wild Chinese soft-shelled turtles using sequential extraction procedures and their antioxidant activities were investigated by DPPH free radical scavenging and reducing power assays. It was found that the glycoprotein and water-soluble protein fractions had higher antioxidant effect in a positive concentrationdependent fashion, with half maximal inhibitory concentrations (IC50) of 0.21 mg/mL and 1.94 mg/mL, respectively. These results suggest that the protein fractions from Chinese soft-shelled turtle possess strong antioxidant activities and have a great potential to be developed as a healthcare food or a nutriceutical.

Key words：Chinese soft-shelled turtle (Pelodiscus sinensis)；sequential extraction；purification；amino acids；antioxidant capability

中华鳖(Pelodiscus sinensis)学名鳖，又称水鱼、团鱼、鼋鱼、元鱼、老鳖、王八，自古就是我国传统食疗滋补佳品。其具有丰富的蛋白质，不但含有极高的胶原蛋白，而且富含18种氨基酸[1-2]。中华鳖具有许多生理功能，如抗氧化、提高机体免疫、促进伤口愈合、滋阴、滋补、提高血浆蛋白含量、促进造血功能、增强体力、清热等，而这些活性均与抗氧化性质有关[3-4]。中华鳖自2005年以来每年产量在14万t以上，产值在50亿元以上，其资源非常丰富，但目前关于中华鳖的研究报道很少，对其活性成分的研究还是空白。

本实验采用分步提取法对中华鳖的蛋白类成分进行提取和纯化，并对所获各组分的蛋白质含量及其抗氧化活性进行研究，包括DPPH自由基的清除能力和还原能力，并对抗氧化性最佳的组分进行氨基酸组成分析，以期为中华鳖活性成分的研究与药物的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华鳖 杭州天福生物科技有限公司；标准蛋白升正生物技术有限公司；除测氨基酸用的试剂为优级纯外，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器与设备

JD-600型9200超声波细胞破碎机、UV-2000紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；IB-81型隔水恒温培养箱 日本岛津公司；FOSS Kjeltec 2300凯氏定氮仪 瑞典丹麦福斯集团；DDY-2C型电泳仪 北京六一仪器厂； FR-200A电泳凝胶成像系统 美国UVP Geldot公司；蛋白质纯化系统 瑞典AKTAprime公司；FD-5型真空冷冻干燥机、CR 21G型台式冷冻离心机、L-8800氨基酸全自动分析仪 日本日立株式会社；81-2型恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；精密电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 活性物质的分离提取

活性物质的提取流程如图1所示。

图1 中华鳖蛋白组分分步提取流程图Fig.1 Procedures for sequential extraction of protein fractions from Chinese soft-shelled turtle(Pelodiscus sinensis)

1.3.2 分离组分的纯化

将鳖粉提取出来的各组分样品分别进行纯化，纯化采用葡聚糖凝胶SephadexG-100柱层析法，将葡聚糖凝胶SephadexG-100充分溶胀抽气后装柱，柱型 1.6cm×50cm。用蛋白质纯化系统(瑞典AKTAprime System)进行纯化，缓冲液为去离子水，流速为 1mL/min，管速2min/管，以去离子水为洗脱剂，根据洗脱峰，分部收集，合并活性峰。洗脱后样品经透析袋(粒径：14000μm)透析，自动检测并收集目的物，得纯化后的各组分样品。

1.3.3 分离组分蛋白质含量的测定

参照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》方法[5]。

1.3.4 分离组分抗氧化活性研究

1.3.4.1 分离组分蛋白还原力的测定

在10mL试管中分别加入不同质量浓度样品各1mL，0.2mol/L、pH6.6的磷酸盐缓冲溶液2.5mL和1%铁氰化钾5mL，置于50℃水浴中20min后急速冷却，加入10%的三氯乙酸5mL，于3000r/min离心10min，取上清液5mL，加入5mL蒸馏水和1mL 0.1%的三氯化铁溶液，混匀后室温下反应10min，于700nm波长处测定吸光度，反应物的吸光度越高表明还原力越强[6-7]。

1.3.4.2 分离组分蛋白DPPH自由基清除率的测定

吸取不同质量浓度的6组样品各1mL，加0.025mg/mL的DPPH自由基甲醇溶液4mL。室温下避光静置1h后于波长517nm[8-9]处测定吸光度。每份样品平行操作3次，DPPH自由基的清除率通过下式计算。

式中：A0为DPPH自由基与溶剂混合液的吸光度；Ai为样品与DPPH自由基反应后的吸光度；Aj为样品与溶剂混合液的吸光度。

实验重复3次，求得清除率的平均值。绘制清除率对质量浓度曲线，计算出清除率为50%时的质量浓度值，即为IC50值[10-11]。

1.3.5 分离组分蛋白的分子质量测定

电泳：采用不连续聚丙烯S D S-酰胺凝胶电泳(PAGE)垂直板电泳法检测甲鱼分离蛋白的分子质量[12-13]。电极缓冲液为25mmol/L Tris-192甘氨酸-0.1% SDS缓冲系统(pH8.3)。10%分离胶，5%浓缩胶，凝胶厚度为1.0mm。在8mA电流下电泳约2h，进入分离胶后调电流至12.5mA，待溴酚蓝染料前沿达分离胶底部时电泳结束。

显色和脱色：染色液(0.1%考马斯亮蓝R-250，45%甲醇，10%冰醋酸)染色0.5h，再取出凝胶浸入脱色液(45%甲醇+9%醋酸)中脱色，直至凝胶本底色带清晰。

扫描：用凝胶成像系统扫描凝胶。

标准曲线的绘制：用卡尺测量溴酚蓝和各种标准蛋白谱带的迁移距离，溴酚蓝染料迁移距离为5.9cm，Rm=标准蛋白(样品)迁移距离(cm)/溴酚蓝迁移距离(cm)。以标准蛋白质的迁移率为横坐标，以其对应的分子质量的对数为纵坐标绘图，绘出已知分子质量即标准蛋白的标准曲线。然后根据未知样品的迁移率，在曲线上查出其对应的分子质量的对数，取其反对数即为分子质量。蛋白质分子质量对数(y)与迁移率(x)的回归方程为：y=5.1271－1.0283x(R2=0.9855)。

2 结果与分析

2.1 分离组分的蛋白质含量

各分离组分的蛋白质含量分别为：组分1为2.203mg/mL，组分2为50.413mg/mL，组分3为20.009mg/mL，组分4为20.524mg/mL，组分5为40.435mg/mL，组分6为非蛋白组分。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 还原力的测定结果

图2 中华鳖提取物各组分还原力比较Fig.2 Concentration dependence of reducing power of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由图2可知，随着各组分样品质量浓度的增大各组分的还原能力也依次增强，但各组分的还原力存在一定差异。6个组分还原力的大小顺序依次为1＞2＞3＞5＞4＞6。经直线回归分析，回归方程分别为：y1=0.3374x+0.0413(R2=0.9962)；y2=0.2536x+0.0185(R2=0.9907)；y3=0.2561x－ 0.0655(R2=0.9789)；y4=0.1361x+0.0805(R2=0.9345)；y5=0.1395x－ 0.07(R2=0.9925)；y6=0.0441x－ 0.002(R2=0.9449)。

2.2.2 DPPH自由基清除率的测定结果

图3 中华鳖提取液各组分清除DPPH自由基的量效关系Fig.3 Concentration dependence of DPPH free radial scavenging capacity of various protein fractions from Chinese soft-shelled turtle

由图3可知，各组分对 DPPH自由基均有不同程度的清除作用，且清除率随样品质量浓度的增加而增强。经直线回归分析(回归方程分别为：y1=11.303x+47.584(R2=0.9979)；y2=8.9186x+32.761(R2=0.9997)；y3=5.3231x+8.334(R2=0.9611)；y4=10.798x+6.1495(R2=0.9721)；y5=8.4111x+10.084(R2=0.9919)；y6=4.6474x－0.213(R2=0.9894)，其清除率均与其质量浓度成明显的直线关系。经计算各组分的IC50值分别为：0.21、1.94、3.56、4.06、4.76、10.80mg/mL。IC50值越低，其对应的参试样品抗氧化活性越强。样品的IC50值排序为1＜2＜3＜4＜5＜6。

2.3 分离蛋白的SDS-PAGE电泳

图4 中华鳖各组分的SDS-PAGE电泳图谱Fig.4 SDS-PAGE of various protein fractions from Chinese softshelled turtle

图5 相对电泳迁移率与lgMW之间的关系Fig.5 Relationship between relative electrophoretic mobility and lgMW

由图4、5可知，组分1主要为糖蛋白成分，没有明显的蛋白条带。组分2为水溶性蛋白组分，分子链的分子质量为200、39.4、32.2、28、25.9、23.4kD和15.3kD，并且在分子质量100kD与40kD之间，有少量蛋白溶出，由于样品处理过程中添加了巯基乙醇，因此推断组分2的蛋白中可能含有二硫键，被巯基乙醇破坏后解离成分子质量更小的几条链。组分3为碱溶性蛋白，有分子质量为38.6kD的一个条带。组分4为酸溶性蛋白，有分子质量为66.2kD的一个条带。综合以上数据，可以得到，各组分含有几种不同分子质量的蛋白，且差异较大，但是分子质量基本在10～200kD。

3 讨 论

本实验通过对抗氧化能力的测定发现，糖蛋白及水溶性蛋白具有较强的还原力及DPPH自由基清除活性，同时得出其抗氧化性和质量浓度呈明显的线性相关，在一定范围内，质量浓度越高，抗氧化性越强，说明其具有良好的抗氧化活性，由此，可将其添加至功能性抗氧化食品中，不仅增加食品营养，更具有多种保健功能，另外，同样可用于食品保藏等其他领域。中华鳖抗氧化作用显著，同时也是使用者良好的蛋白来源，其在食品、医药等工业中有广阔的应用前景，但关于中华鳖活性组分多肽的进一步分离、纯化、鉴定还有待于进一步研究。

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Sequential Extraction of Protein Fractions from Chinese Soft-shelled Turtle (Pelodiscus sinensis) and Their Antioxidant Activities

LIU Yan1，LIU Cheng-chu1,*，YANG Jing-ya1，LIU Qi-gen2，LI Ying-sen2，LI Jia-le2,3
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University,Shanghai 201306, China；3. Aquaculture Division, E-Institute of Shanghai Universities, Shanghai 201306, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)21-0081-04

2010-06-28

上海海洋大学骆肇荛大学生科技创新基金项目(A-2900-08-001519)；农业部公益性行业(农业)科研专项(200903028)；上海高校创新团队建设项目；上海市教育委员会重点学科建设项目(J50704)

刘彦(1985—)，女，硕士研究生，研究方向为海洋资源开发与利用。E-mail：79030199@163.com

*通信作者：刘承初(1965—)，女，教授，博士，研究方向为海洋生物资源利用、营养与食品安全。E-mail：ccliu@shou.edu.cn