原子荧光光谱法测定六神丸的总砷含量及其在人工肠液中的可溶性砷含量

吴庆晖， 黄伯熹， 杨运云， 张志军， 黄璇莹

（1.中国广州分析测试中心，广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070；2.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广东 广州 510623）

六神丸是著名的传统中成药，由清代名医雷允上创制，已有100多年历史。其处方由蟾酥、雄黄、麝香、珍珠、牛黄、冰片组成。具有解毒、消肿、止痛等多种功效［1］。六神丸的组方之一雄黄主含二硫化二砷(As2S2)［2］。由于其含砷量高，因过量服用六神丸而中毒的事件时有发生。中国药典(2005版一部)附录46对中成药中砷的检测采用古蔡氏法(砷斑法)或二乙基二硫代氨基甲酸银法(银盐法)，这两种方法操作繁琐，需时较长，准确度、灵敏度有限。原子荧光光度计测定六神丸的总砷含量及其在人工肠液中的可溶性砷含量方法尚未见文献报道［3］，本方法具有灵敏度高，干扰少，操作简便等优点，能获得较好的检出限和精密度，为六神丸在临床上的合理用药和安全性提供实验依据。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

AF-640双道原子荧光光度计(北京瑞利仪器厂)；PYX-150S-C生化培养箱；Lab Tech可控温电加热板(北京莱伯泰科公司)；移液器 P5000(法国GILSON)；电子天平(Sartorius)BS 110S。

As标准贮备液 GSB G 62028-901000 μg/mL(国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院)；胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；高纯氩:＆gt；99.99%；其他试剂均为分析纯，实验用水采用去离子水。所有实验器具用前均以50%HNO3浸泡24 h并以去离子水洗净备用。六神丸(苏州雷允上药业有限公司)。

1.2 仪器条件

经优化后的仪器条件如下:

HCL主阴极电流:35 mA；HCL辅助阴极电流:35 mA；PMT电压:270 V；氩气载气流量:600 mL/min；氩气辅助气流量:100 mL/min；原子化器温度:200℃；采样泵速:100 r/min；采样时间:4 s；注入泵速:100 r/min；注入时间:16 s；原子化方式:火焰法；读数时间:14.0 s；延时时间:0.0 s；测量方法:标准曲线法；读数方法:峰面积。还原剂:含4 g/L氢氧化钾的1.4%硼氢化钾(使用前配制)；预还原剂:50 g/L硫脲+50 g/L抗坏血酸(使用前配制)；载流:10%(V/V)盐酸。

1.3 标准工作曲线

用含10%HCl和10%预还原剂溶液把砷标准贮备液逐级稀释至 0.00，5.00，10.00，20.00，40.00，60.00，120.00 ng/mL的标准系列工作溶液。上机测定系列标准溶液，得到线性回归方程:I=84.03+124.9 C，回归系数r=0.9998。

1.4 六神丸中总砷的测定

1.4.1 样品前处理 取样品约0.03 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，分别加入浓硫酸2 mL，高氯酸2 mL，浓硝酸2 mL，浓盐酸2 mL。摇匀后置于电加热板中在180℃温度下进行消化，消解至样品冒白烟，若剩余消解液仍有棕色，取下冷却，补加一定量浓硝酸继续消解，至样品冒白烟且颜色呈消解液无色透明，之后再持续消解5 min，以赶掉剩余的硝酸。冷却，加入预还原剂2.5 mL，用去离子水把消解液转移至25 mL比色管中，定容。静置15 min，待上机测定。

1.4.2 方法检出限和重复性试验 对样品空白溶液连续测定11次，用3倍的样品空白值标准偏差(3σ)除以标准工作曲线斜率(b)求出本方法检出限为0.12 ng/mL。平行处理7份样品，进行上机测定，测得样品中砷的荧光强度值，计算得出砷含量的RSD为3.51%。

1.4.3 稳定性试验 另取一支样品试液，在室温20℃ ～25℃条件下每隔15 min测定1次，测得样品中砷的荧光强度值，计算得出砷含量的RSD为3.96%。样品试液在3 h内稳定。

1.4.4 加样回收试验 准确称取已知砷含量的六神丸5份，各0.03 g，分别加入1000 μg/mL砷标液3 mL，按1.4.1项下方法进行样品前处理，上机测定，砷回收率为93.6% ～104.1%。

1.4.5 样品测定 取样品批号为:HA 1005(20081007)的六神丸3份平行样品，依1.4.1项方法进行前处理，上机测定，其总砷含量为:8.13%。

1.5 六神丸在人工肠液中可溶性砷的测定

1.5.1 人工肠液的配制

人工肠液 C1的配制［4］:取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000 mL即得。

不加胰蛋白酶的人工肠液C2的配制:不添加胰蛋白酶，其余均同人工肠液C1。

1.5.2 样品溶液的配制

1.5.2.1 称取六神丸100粒，计算每粒六神丸平均重量。然后用研钵研细，按四分法分样，取约等于10粒六神丸重量的粉末样品，精密称定，转移至具塞锥形瓶中，加入人工肠液C1700 mL，此为样品溶液L1。将其放置入生化培养箱中，在37.0℃条件下静置。每隔一段时间(10、20、30、40、50、60、120、180、240、300、360 min)，用移液器吸取溶液清液 5 mL，转移至10 mL比色管中，加入HCl 1.0 mL。上机前，加入预还原剂1.0 mL，加去离子水定容，静置15 min，上机测定。

1.5.2.2 按1.5.2.1项进行样品溶液的配制，其中把人工肠液C1替换为不加胰蛋白酶的人工肠液C2，此为样品溶液L2。

1.5.2.3 按1.5.2.1项进行样品溶液的配制，其中把人工肠液C1替换为去离子水，此为样品溶液L3。

1.5.3 可溶性砷样品溶液的测定结果 六神丸在人工肠液C1(L1)、不加胰蛋白酶的人工肠液C2(L2)、去离子水(L3)中不同时间段可溶性砷含量的测定结果(n=3)见表1，图1。

2 结果与讨论

2.1 本实验建立了原子荧光光谱法测定六神丸中的总砷含量，结果准确、快速，灵敏度和精密度高，测定结果总砷含量为8.13%，折算为雄黄(As2S2)的含量为11.6%。文献［5-6］中报道的含雄黄中成药的雄黄含量范围为:1.3%～14.3%。若按成人每日服用量30粒计，每日摄入的总砷为7620 μg。世界卫生组织对标准体重60 kg成人总砷每日最大摄入量的限量标准为 128 μg。

表1 六神丸中可溶性砷含量的测定结果Tab.1 The determination results of soluble arsenic in Liushen Pills

图1 六神丸在不同试液中随时间变化的可溶性砷浓度变化趋势Fig.1 The concentration change trend of soluble arsenic of Liushen Pills in different test solutions with time

2.2 目前我国对于中药材和中成药中有毒害元素砷的限量指标仅见于中国药典(2005版一部)中丹参、黄芪、甘草等6种中药材。由于六神丸中含雄黄，雄黄的主要成分为As2S2，如果以总砷为指标并作评价，会导致其砷含量大大超标。有文献［7-8］认为雄黄的主要成分硫化砷很可能是不能被机体所吸收的无活性成分，其生物药理活性为可溶性部分。本实验对六神丸在人工肠液中可溶性砷含量进行了研究，测定结果为可溶性砷约占总砷含量的10.5%。若仅有可溶性砷全部被人体吸收，以成人每日服用量30粒计，每日摄入的可溶性砷约为800 μg。

2.3 本实验对六神丸在人工肠液中不同时间段(10、20、30、40、50、60、120、180、240、300、360 min)溶出砷的含量进行了研究。结果表明在10 min后，六神丸中的砷在人工肠液中的溶出达到平衡。这与文献［9］报道的六神丸中砷在家兔体内药动学参数中达峰时间的实验结果是一致的，说明六神丸中的可溶性砷在人体内的溶出和被吸收速度快，这可能是在临床上因过量服用六神丸造成急性中毒的原因之一。

2.4 本实验还考察了六神丸在人工肠液(L1)、不加胰蛋白酶的人工肠液(L2)、去离子水(L3)中可溶性砷含量的结果。结果表明，六神丸在不同溶液中可溶性砷的含量是:L1＆gt；L2＆gt；L3。此外，六神丸在人工肠液(L1)、不加胰蛋白酶的人工肠液(L2)中10 min后达到了溶出平衡，而作为对照组的去离子水(L3)中，六神丸要到20 min～30 min后才逐渐达到了溶出平衡。人工肠液中的胰蛋白酶作为一种生物活性大分子物质，对六神丸中的砷溶出有促进作用，而在去离子水中则需要更长的时间达到平衡。

［1］高学敏，李庆业.实用中成药［M］.北京:中国科技出版社，1991:138.

［2］中国药典［S］.一部.2005:236.

［3］舒永红，何华焜.原子吸收和原子荧光光谱分析［J］.分析实验室，2007，26(8):112-113.

［4］中国药典［S］.二部.2005:附录158.

［5］黄 隽，靳建中，朱惠珍，等.石墨炉原子吸收分光光度法测定中成药中雄黄含砷量［J］.药物分析杂志，1993，14(2):47-50.

［6］刘小兰.中国药典雄黄炮制方法与中成药三氧化二砷含量［J］.北京中医，2000，(1):50.

［7］王金华，叶祖光，梁爱华，等.安宫牛黄丸中汞、砷在正常和脑缺血模型大鼠体内的吸收与分布研究［J］.中国中药杂志，2003，28(7):639-642.

［8］梁国刚，张启伟.朱砂、雄黄中各成分的溶解度对其药效、毒副作用的影响［J］.中国中药杂志，2002，27(5):391-392.

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