杨梅叶、枝和树皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,张 英,吴晓琴

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310029)

杨梅叶、枝和树皮提取物抗氧化活性研究

傅燕玲,张 英,吴晓琴＊

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,浙江杭州 310029)

采用DPPH法、ABTS法、Rancimat法及血液体系总抗氧化能力测定法研究杨梅叶、枝和树皮提取物的抗氧化活性。结果表明,杨梅叶、枝和树皮提取物清除DPPH·、ABTS+·能力显著强于阳性对照。杨梅枝提取物清除DPPH·能力最强,为 1907.5±6.40mg TEAC/g,叶次之,皮最弱;杨梅叶提取物清除 ABTS+·能力最强,为 1692.90±31.81mg TEAC/g,枝次之,皮最弱。提取物对山茶油的抗氧化能力与其添加剂量呈量效关系,在 0.02%添加剂量下,各提取物对山茶油的抗氧化能力表现为 TBHQ＞皮提取物 ＞叶提取物 ＞枝提取物 ＞VE。血液体系总抗氧化能力从强到弱的排序依次为VC＞枝提取物 ＞叶提取物 ＞皮提取物。

抗氧化活性,DPPH·,ABTS+·,山茶油

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荸荠杨梅叶、枝和树皮 2007年 7月份采于浙江余姚,40℃烘干,粉碎后过 20目筛;鲜榨山茶油; DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、ABTS[2,2′-azino-bis-(3-ehyl benzothiazoline-6-sulfonic acid)、Trolox Sigma,美国;总抗氧化能力试剂盒 南京建成生物工程研究所;过硫酸钾、特丁基对苯二酚(TBHQ)、维生素 E、维生素 C、硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、福林-酚试剂、碳酸钠、芦丁、杨梅素、没食子酸、无水乙醇、甲醇等 均为分析纯试剂。

Ranc imat743食用油脂氧化稳定性测定仪 瑞士Metrohm公司;TU-1810紫外-可见 (UV-V IS)分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;FA1004型电子天平 (万分之一) 上海精密科学仪器有限公司;R-201型真空旋转蒸发仪 上海申科机械研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 杨梅叶、枝和树皮有效成分的提取 采用70%乙醇热回流浸提杨梅叶、枝和树皮中有效成分。浸提温度为 80℃,料液比为 1∶10,回流提取 2次,每次 2h,除去残渣后旋转蒸发回收溶剂。浓缩液溶于一定量水中,用石油醚除去蜡质、色素、油脂等弱极性物质,再以 1∶3溶剂量的乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯萃取物,旋转蒸发除去溶剂,经冷冻干燥分别得到杨梅叶、枝和树皮提取物(MLE、MBR、MBA)样品,放入干燥器中备用。

1.2.2 DPPH·清除能力测定 在Bao等[5]所建立方法的基础上进行改良,配制质量浓度为 0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0mg/L的 Trolox溶液,分别取 50μL与5mL浓度为 1×10-4mol/L的 DPPH·甲醇溶液混合测定 517nm处的吸光值,建立标准曲线。配制一定浓度的样品甲醇溶液,样品的测定同标准曲线,以不加样品的DPPH·甲醇溶液为空白,每个样品平行测定三次。自由基清除率按下式进行计算：

式中：Acontrol为空白的吸光值;Asample为样品吸光值。

1.2.3 ABTS+·清除能力测定 先将ABTS溶于甲醇中制备成 7mmol/L的储备液,然后取 5mL ABTS储备液和 88μL 140mmol/L的过硫酸钾溶液混合,得到 2.45mmol/L的ABTS+·贮备液;将该溶液于 20℃下避光放置 12～16h。最后将生成的 ABTS+·储备液用甲醇稀释,使其在 734nm波长下的吸光值为0.70±0.02,即得到ABTS+·工作液。

参考 Re[6]等和 Cai[4]等的方法,配制浓度为 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mmol/L的 Trolox溶液,分别取40μL与 4mL ABTS+·溶液混合,摇匀,6min后于734nm下测定其吸光值,建立标准曲线。配制一定浓度的样品甲醇溶液,样品的测定同标准曲线,以不加样品的溶液为空白,每个样品平行测定三次。自由基清除率按下式进行计算：

式中：Acontrol为空白的吸光值;Asample为样品吸光值。

1.2.4 对油脂抗氧化能力测定 采用 Ranc imat法,其基本原理是基于向一定温度的油样中通入一定流量的空气,使油样加速氧化,将氧化产生的挥发性小分子(如醛、酮、酸等)导入装有蒸馏水的瓶中,记录瓶中水的电导率变化情况,并求出诱导时间,记为I p。诱导时间越长,表明油样抗氧化稳定性越好。

参考 Sun等[7]的方法,分别取 3g油样至Ranc imat仪的样品管,调节空气流量为 20L/h,设定温度为 120℃。准确称取杨梅叶、枝和树皮提取样品,用少量甲醇溶解,并将其加入到山茶油样品中,配制成样品添加量分别为 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的油样。以山茶油中添加相应量的溶解样品的溶剂为空白,以相同剂量的 TBHQ、VE为阳性对照,分别测定空白、阳性对照和提取样品对山茶油的诱导时间,并计算各阳性对照和试样的相对抗氧化能力,每个样品平行测定三次。

1.2.5 全血体系总抗氧化能力测定 原理：利用抗氧化物质能使 Fe3+还原成 Fe2+,后者可与斐林类物质形成稳定的络合物的性质,从而可以通过比色法测定受试样品在全血体系中抗氧化能力的强弱。

取一定量的血清,取一定浓度的样品,按照总抗氧化能力试剂盒 (T-AOC)操作说明进行测试。以VC作为阳性对照。全血总抗氧化能力(T AC)计算方法如下：

其中,V0=3.8mL,V1=0.1mL;A1为加入提取物后反应体系的吸光度;A0为空白反应体系吸光度。

1.2.6 数据统计 采用 Excel和 SPSS 16.0软件进行数据处理和统计分析。所有样品均平行测定三次,测定结果以平均值 ±标准偏差(mean±SD)表示,显著性界值 p=0.05。

2 结果与讨论

2.1 清除DPPH·能力

DPPH法[8]自上世纪五十年代开始就用于天然产物的 H-供体的测定,后用于单一抗氧化物或天然物质的抗氧化能力测试。DPPH·是一种性质较为稳定的自由基,溶于甲醇、乙醇等极性溶剂中,在517nm处有最大吸收,当有自由基清除剂存在时, DPPH·的单电子由于被配对,会发生脱色反应,因此可用吸光度的变化并以 Trolox等作为对照体系量化抗氧化物质的抗氧化能力。本研究利用该法来比较杨梅叶、枝、树皮提取物对DPPH·清除能力,以芦丁作为阳性对照来评价其抗氧化能力,结果如图 1、表1所示。

图 1显示,在低浓度范围内,随着试样浓度的增大,自由基的清除率呈线性增长,当达到一定浓度时,自由基的清除率趋于平缓。提取物中清除 DPPH·的能力为枝最强,其半抑制浓度达 1907.5±6.40mg TEAC/g,其次是叶和皮,都明显强于阳性对照芦丁,这说明杨梅叶、枝和树皮乙酸乙酯萃取物都有较强的清除DPPH·能力。DPPH·有一定选择性,它不和B-环上无羟基的黄酮类物质发生反应,也不与芳香酸 (aromatic acid)反应[9],因此,相对于杨梅叶和树皮提取物来说,杨梅枝提取物的 B-环上无羟基的黄酮类物质和芳香酸含量可能相对较少。

表 1 杨梅叶、枝、树皮提取物清除DPPH·和ABTS+·的抗氧化能力

图1 杨梅叶、枝、树皮提取物和阳性对照芦丁清除DPPH·的浓度依赖关系(n=3)

2.2 清除ABTS+·的能力

ABTS法是使用最广泛的间接检测方法,可用于亲水性和亲脂性物质抗氧化能力测定。ABTS经氧化后生成稳定的蓝绿色阳离子自由基 ABTS+·,能溶于水相或酸性乙醇介质中,在 734nm处有最大吸收。当有自由基清除剂存在时能与ABTS+·发生反应而使反应体系褪色。在ABTS+·的最大吸收波长检测吸光值的变化,并与 Trolox比较从而换算出被测物质总的抗氧化能力。杨梅叶、枝、树皮提取物清除ABTS+·情况如图 2、表 1所示。由图 2可见,随着试样和阳性对照浓度的增加,其 ABTS+·清除率呈稳步增大,当试样浓度达到一定浓度时,ABTS+·清除率呈缓慢增长趋势。由表 1可看出,杨梅叶、枝和树皮提取物清除ABTS+·能力显著强于阳性对照芦丁,其中以杨梅叶最强,为 1692.90±31.81mg TEAC/g,其次是枝,皮最弱。据文献报道[10],天然植物提取物清除 ABTS+·能力与其总酚含量呈正相关,杨梅叶、枝与树皮提取物清除ABTS+·能力存在显著差异,这种差异可能就是由其总酚含量差异所致。

图2 杨梅叶、枝、树皮提取物和阳性对照芦丁清除ABTS+·的浓度依赖关系(n=3)

2.3 杨梅叶、枝和树皮提取物的抗油脂氧化能力

取一定量山茶油,分别加入油样量的 0.02%、 0.03%、0.04%、0.05%的杨梅叶、枝和树皮提取物,置于 Ranc imat743仪中,通过电导率的变化来确定诱导时间的长短。杨梅叶、枝和树皮提取物及阳性对照TBHQ、VE对山茶油抗氧化作用测定结果如表 2所示,其中各种抗氧化剂的抗氧化能力用保护系数 Pf表示,Pf=I p样品 /I p空白。

表 2 120℃时不同添加量的杨梅叶、枝、树皮提取物对山茶油的保护系数 Pf

由表 2可知,杨梅叶、枝、树皮提取物加入到山茶油都能明显延长山茶油诱导时间,而且随着添加量增加,其诱导时间增长,这表明提取物添加剂量与其抗氧化活性之间存在量效关系。当添加量在0.03%以上,其 Pf都大于 2,表明杨梅叶、枝、树皮提取物对山茶油具有很好的抗氧化能力。当添加量为0.02%时,各物质对山茶油的抗氧化能力表现为TBHQ＞皮提取物 ＞叶提取物 ＞枝提取物 ＞VE。

2.4 总抗氧化能力测定

评价提取物总抗氧化能力的方法因其作用机理的差异可分为直接法和间接法。直接法是研究含有抗氧化物质的样品对整个测试系统的氧化降解性,氧化的对象可能为单一脂类、脂混合物、蛋白质、DNA或者是含脂的混合物,如血浆、低密度脂蛋白和生物膜等[10]。直接法研究抗氧化物质在自由基的引发、传递、清除等过程中所起的作用,在理论上更为充分。因此为了更好更全面评价杨梅叶、枝和树皮提取物抗氧化能力,采用血体系液总抗氧化能力来评价。该种方法实质是测试样品在生物体系中的还原能力,实验以VC作为阳性对照,结果如表 3所示。抗氧化能力从强到弱的排序依次为VC＞枝提取物 ＞叶提取物 ＞皮提取物。

表 3 杨梅叶、枝、树皮提取物总抗氧化能力

3 结论

采用DPPH·和ABTS+·清除法研究杨梅叶、枝和树皮提取物的抗氧化能力,是一种快速、简便、灵敏可行的方法。杨梅叶、枝和树皮提取物具有较好的清除DPPH·和ABTS+·的作用,明显强于阳性对照芦丁,且随着化合物浓度的增加,对 DPPH·和ABTS+·的清除作用逐渐增强,表明提取物剂量与清除自由基的能力间存在量效关系。其中以杨梅枝提取物清除DPPH·能力最强,叶次之,皮最弱;杨梅叶提取物清除ABTS+·能力最强,枝次之,皮最弱。

杨梅叶、枝和树皮提取物在山茶油中均有较强的抗氧化活性,在一定添加剂量范围内,其抗氧化活性与添加量存在量效关系,且 0.05%提取物的效果优于0.02%TBHQ;在0.02%添加剂量下,各种提取物对山茶油的抗氧化能力表现为 T BHQ＞皮提取物 ＞叶提取物 ＞枝提取物 ＞VE。在全血体系下的抗氧化评价实验能更加真实反映提取物的抗氧化能力,结果显示其抗氧化能力从强到弱的排序依次为 VC＞枝提取物 ＞叶提取物 ＞皮提取物。

本研究结果表明,杨梅叶、枝和树皮提取物含有较好的清除自由基,抗山茶油氧化及全血抗氧化能力,是一种极有潜力的天然抗氧化剂资源,其在食品、化妆品及药品方面的研究将成为今后的工作重点。

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Study on antioxidant activity ofMyrica Rubra leaves, branches and barks extract

FU Yan-ling,ZHANG Y ing,W U Xiao-qin＊
(College ofBiosystem Engineering and Food Science,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310029,China)

2,2-D ip henyl-1-p ic rylhyd razyl(DPPH),2,2′-Azino-b is-(3-ehylbenzothiazoline-6-sulfonic ac id (ABTS),Ranc im a t and tota l antioxidant ab ility in b lood assays we re used to ana lyze the antioxidant ab ility of M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t.It showed tha t,M yrica Rub ra leaves,b ranches and ba rks extrac t showed s tronge r ab ility to scavenge free red ica ls when comp a ring to the control samp le.Am ong them,w ith the abundance of1907.5±6.40m g TEAC/g,the b ranches extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge DPPH·, then followed by leaves and ba rks,while w ith the abundance of1692.90±31.81m g TEAC/g,the leaves extrac t showed the s tronges t ab ility to scavenge ABTS+·,followed by b ranches and ba rks.It was a dosage-dep endent effec t be tween the antioxidant cap ab ility to cam e llia oil and the add ing am ount,w ith the add ing am ount of0.02%, the antioxidant ab ility to cam e llia oil of extrac ts was as follows：TBHQ ＞ba rks extrac t＞leaves extrac t＞b ranches extrac t＞VE,and the tota l antioxidant comp e tence in the b lood cond ition was as follows：VC＞b ranches extrac t＞leaves extrac t＞ba rks extrac t.

antioxidant ab ility;DPPH·;ABTS+·;cam e llia oil

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0196-04

杨梅 (M yrica rubaSieb.et Zucc)系杨梅科杨梅属植物,它的果实、叶和树皮含有丰富的多酚类物质。杨梅叶中含多种酚类化合物,主要由黄酮类化合物及花色素类化合物组成,这两类化合物均有显著的生理活性[1]。杨梅树皮可分离出杨梅素、槲皮素及槲皮素-o-α-L-鼠李糖苷等黄酮类化合物[2],且味苦、性温,具有散瘀止血、止痛之功效,民间用于治疗跌打损伤、骨折、痢疾、胃和十二指肠溃疡、牙痛等[3]。人体内的氧化和抗氧化处于动态平衡,当这种平衡被打破就会发生氧化应激。人体能通过自身的调节耐受轻度的氧化应激,但严重的氧化应激则需要补充抗氧化剂来补救。许多现代文明病与人体缺乏抗氧化营养物质有关,而补充抗氧化营养物质则有助于对这些疾病的预防治疗,因此寻找天然、安全、有效的抗氧化剂资源就显得尤为重要。本文采用热回流法提取杨梅叶、枝和树皮中的有效成分,通过清除自由基,对油脂的抗氧化及全血体系抗氧化等方法对提取物抗氧化作用进行研究,以期为综合开发利用杨梅非果部位资源提供一定的参考。

2009-04-03 ＊通讯联系人

傅燕玲(1984-),女,硕士研究生,研究方向：天然产物的研究与开发。