非水相中固定化酶水解制备玉米肽的体外醒酒活性研究*

吴晖，李丽丽，李晓凤，余以刚

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

非水相中固定化酶水解制备玉米肽的体外醒酒活性研究*

吴晖，李丽丽，李晓凤，余以刚

(华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州，510640)

对在非水相中经固定化碱性蛋白酶Alcalase 2.4L水解的玉米蛋白肽的体外醒酒活性进行了研究。考察了在体外试验中，玉米肽对乙醇脱氢酶(ADH)及对乙醛脱氢酶(ALDH)活力的影响，分析了活性最高的酶解物的氨基酸组成和相对分子量分布及其与醒酒活性之间的关系。结果表明:当控制水解度最高为22.7%时，非水相中制备的玉米肽在体外试验中对乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH)的激活作用最高，ADH激活率可达27.1%，ALDH激活率可达50.0%，此高醒酒活性肽中含有较高比例的Ala、Leu及Pro，尤其是Leu，3种氨基酸含量均高于相同水解度下水相中制备的玉米肽的氨基酸含量。在酶解产物分子量＜3 548 u，其中分子量＜1 295 u的肽含量最多，约占80%，以2～10肽为主。

非水相，固定化，玉米肽，醒酒活性

玉米蛋白粉是玉米湿法加工中的主要副产物，蛋白质含量达60%以上，但由于玉米蛋白溶解性差［1］，缺乏赖氨酸等必需氨基酸，严重限制了其在食品中的应用。玉米蛋白粉经酶水解得到的活性肽具有促进乙醇代谢及消除疲劳［2］、抗氧化［3］、降低血氨浓度及降血压［4］的作用。Yamaguchi等率先利用碱性蛋白酶水解玉米蛋白，制得了具有生理活性的玉米肽，并发现玉米肽具有促进酒精代谢作用［4－6］。经常过量饮酒，会损害肝、胃、脾等内脏器官，造成胃溃疡、肝硬化等疾病［7］。近年来，随着国民经济水平的提高和保健意识的增强，大众越来越重视解酒保健问题。因此，利用纯天然玉米黄粉制备高醒酒活性玉米肽，具有较高的实践价值和应用意义。

应用游离蛋白酶在水相中对玉米蛋白进行水解制备玉米肽已经有不少报道［7］。但在非水相中进行酶解反应且深入研究其与体外醒酒活性的关系的报道较少。基于上述研究现状，本文首次系统探讨了非水相中蛋白酶催化玉米蛋白粉所得各水解物的不同水解度与其体外醒酒活性的关系，并确立了非水体系中可控酶解制备高醒酒活性玉米肽的酶催化体系，旨在为醒酒肽产品的研发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

玉米蛋白粉(蛋白含量为57.31%)，吉林吉发集团提供，过80目筛备用;Alcalase 2，4L FG，酶活力2.4AU/g，购自丹麦Novo公司;氧化型辅酶I(NAD)、吡唑、乙醇脱氢酶ADH(451 U/mg)，购自罗氏公司;乙醛脱氢酶ALDH，购自美国Sigma公司;海藻酸钠、无水 CaCl2、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、HCl、焦磷酸钠、明胶、乙醇(95%)、乙醛、四氢呋喃、异丙醇，均为市售分析纯试剂。

高速离心机，科大创新有限公司中佳分公司;电子分析天平，上海精密科学有限公司;pH-star装置，自制;电动搅拌机，江苏省金坛市进程教学仪器厂;UV－102－02WF紫外可见分光光度计，日本Shimadzu公司;高效液相色谱仪，美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化Alcalase蛋白酶的制备［8］

以海藻酸钠为载体，将Alcalase蛋白酶固定化。

1.2.2 玉米浓缩蛋白粉酶解物的制备［9］

(1)原料脱脂。称取一定量的玉米蛋白粉，按固液比为1∶10加入8%的NaHCO3溶液，放入恒温水浴振荡锅中，40℃，振荡20 min。5 000 r/min离心10 min，并反复水洗，至pH值接近7，收集沉淀得脱脂玉米蛋白粉。

(2)浓缩玉米蛋白的制备。取一定量的脱脂玉米蛋白粉，按固液比1∶10。加入体积分数为95%的乙醇，50～60℃水浴30 min后，用质量分数10%的NaOH调节pH值至9.0。加蒸馏水使乙醇体积分数为60%，萃取30 min，在3 000 r/min的转速下离心5 min，取上清液。用质量分数1%CaCl 1∶1盐析，静置12 h后，离心得湿玉米醇溶蛋白，反复水洗保证pH值在7.0左右，真空冷冻干燥，即得玉米浓缩蛋白粉。

1.2.3 玉米肽酶解反应及产物制备［10］

称取玉米浓缩蛋白粉于具塞三角瓶中，加入醇水(1∶1，v/v)溶液，配成底物浓度为 5%(w/v)，然后置于55℃恒温水浴振荡锅中，振荡10 min以使其充分溶解，加入固定化酶，用量为8%(w/v)，在pH8.5，温度55℃下，控制转速在200 r/min水解一段时间。根据pH-stat法，在反应过程中加入1mol/L的标准NaOH维持反应液的pH不变，通过调节加碱量控制反应的水解度。酶解液经沸水浴10 min灭酶活终止反应后，10 000 r/min冷冻分离10 min，取上清液旋转蒸发浓缩，真空冷冻干燥得产物玉米蛋白肽。

1.3 分析方法

1.3.1 水解度(DH)的测定

采用 pH-stat法［11］。

水解度计算公式:

其中:B，消耗碱量(mL);N，NaOH摩尔浓度(mol/L);α，氨基的平均解离度，α=［10(pH－pK)］/［1+10(pH-pK)］，其中pK为氨基的平均解离常数，按7.0算，pH为反应起始pH值;htot，单位质量底物蛋白质中肽键的摩尔数，对于玉米蛋白 h=7.35 mmol/g;MP的为底物中蛋白质总量(g)。

1.3.2 乙醇脱氢酶活性的测定［12］

本试验采用改良的Valle＆Hoch法测定乙醇脱氢酶(ADH)的活性。在测定管中分别加入焦磷酸钠缓冲液1.5mL(pH值8.8)、0.027mol/L氧化型辅酶I(NAD+)1.0mL，11.5%(V/V)的乙醇溶液0.5mL，0.1mg/mL试验样品溶液0.1mL，混合后，放入25℃的水浴锅中，加盖温育5 min。之后向测定管中加入ADH(0.25 U/mL)0.1mL，摇匀后立即用分光光度计测定其吸光度(A340nm)值，以后每隔10 s读数一次，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。以A值对时间作图，计算 A340nm/10 s的增加值，根据NADH在340 nm处的摩尔吸光系数为6.2，计算酶活力单位。ADH的活性以每分钟NADH生成的纳摩尔数表示，计算公式如下:

1.3.3 乙醛脱氢酶活性的测定［13］

采用改良的Blair＆Bodley方法。在测定管中分别加入100 mmoL焦磷酸钠缓冲液1.6mL(pH值9.5)、3.6 mmoL氧化型辅 I(NAD+)1.0mL，100 mmoL乙醛溶液0.1mL，10 mmoL吡唑0.1mL，0.1mg/mL试验样品溶液0.1mL，混合后，放入30℃的水浴锅中，加盖温育5 min。之后向测定管中加入18 mmoL ALDH 0.1mL，摇匀后立即用分光光度计测定其吸光度(A340nm)值，以后每隔1 min读数1次，直至每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。以A值对时间作图，计算A340nm/1 min的增加值，根据NADH在340 nm处的摩尔吸光系数为6.2，计算酶活力单位。ALDH的活性以每分钟NADH生成的纳摩尔数表示，计算公式如下:

1.3.4 氨基酸分析

采用Waters美国高效液相色谱，PICO.TAG氨基酸分析，柱分别测定了浓缩玉米蛋白粉和玉米肽的氨基酸组成，由华南理工大学测试中心测定。

1.3.5 肽相对分子量分布

酶解物溶液经0.45 μm微孔过滤膜过滤后上TSKgel 2000色谱柱，以牛胰岛素(MW5733.49)、氧化型谷胱甘肽 (MW612.23)、还原型谷胱甘肽(MW307.3)为标准品，测定酶解物的相对分子质量分布。高效液相色谱仪条件:Waters 600(配2487紫外检测器和M32工作站);色谱柱为TSK gel 2000 SWXL［(300 ×7.8)mm］;流动相为乙腈-水-三氟乙酸体积比45∶55∶0.1;检测波长为220 nm;流速为0.5mL/min;柱温为30℃。

2 结果与分析

2.1 酶解物对乙醇脱氢酶(ADH)活力的激活作用

乙醇主要在肝脏内代谢，在肝内代谢主要有3条途径，分别由不同酶系催化，正常情况下进入体内的乙醇90%以上是在脱氢酶系统-ADH和ALDH的催化作用下完成代谢的［14］。

Yokoyama指出，乙醇首先在胃肠内的代谢与胃内ADH的活性有关，提高ADH的活性可减轻乙醇对机体的毒害作用［15］。本实验首先对玉米肽在体外对ADH的活性的影响进行了测定。水解度与ADH激活率的关系如图1所示。

图1 反应水解度对产物ADH激活率的影响

由图1可知，产物的ADH激活率与反应水解度密切相关。当控制反应水解度在10%～22.7%，酶解产物粗肽的ADH激活率随着水解度增加而增加，ADH最大激活率为27.1%。

2.2 酶解产物对乙醛脱氢酶(ALDH)活力的激活作用

乙醛是乙醇代谢后的产物，它可与肝细胞成分结合产生毒性，而且乙醛比乙醇对肝毒性更强。在肝细胞线粒体内乙醛被ALDH氧化为乙酸，当ALDH活性降低时，未被氧化的乙醛进入血内，通过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化物，导致脂质过氧化，破坏细胞膜脂质，促进肝损伤［16］。ALDH活性的高低是玉米肽解酒活性的重要表征。酶解物不同水解度与ALDH激活率的关系如图2所示。

图2 反应水解度对产物ALDH激活率的影响

产物的ALDH激活率与反应水解度密切相关。当控制反应水解度在10%～22.7%，酶解产物粗肽的ALDH激活率随着水解度增加而增加，ALDH最大激活率为50.0%。

体外实验表明玉米肽对ADH，ALDH均有良好的激活作用。

2.3 玉米肽的氨基酸组成

本实验同时对水相中酶解所得的玉米肽(水解度为 23.0%)［17］及非水相中酶解物(水解度为22.7%)的氨基酸组成进行了测定，分析结果见表1。

表1 玉米浓缩蛋白粉及玉米肽氨基酸组成成分分析(mol/%)

由表1可知，浓缩玉米蛋白及玉米肽中氨基酸组成与Yamaguchi的测值［5］比较，浓缩玉米蛋白和玉米肽中的Ala含量低于文献值，但Leu含量比文献值高，浓缩蛋白与玉米肽的Leu含量分别比文献值高1.43 mol%、3.64 mol%。Yamaguchi认为玉米肽的醒酒活性之所以优于小麦肽、豌豆肽，是因为它能显著提高血清中Ala和Leu的浓度，尤其是Leu的浓度［5］。控制水相中与非水相中玉米蛋白酶解反应制取基本相同水解度的酶解物时，非水相中制取的酶解物的Ala、Leu及Pro含量均比水相中制备的酶解物中的高，分别高1.02 mol%，3.18 mol%及1.39 mol%。因此，本试验体系下所获得的玉米肽富含Ala、Leu及Pro，具有高体外醒酒活性。

由表2可知，水相中制备的酶解物的游离氨基酸总量高于非水相中制备的酶解物的游离氨基酸总量，且非水相中酶解物的Ala、Leu及Pro含量均比水相中制备的酶解物中的低，但Ala、Leu及Pro总量均比水相中制备的酶解物中的高，说明非水相中酶解物的Ala、Leu及Pro更多地存在于肽中。至于对乙醇代谢起促进作用的是肽还是游离氨基酸，还需要进一步的实验研究。

表2 酶解物的游离氨基酸组成(mg/g pro)

2.4 玉米蛋白酶解物的分子量分布

采用高效液相色谱法测定该水解产物的分子质量以及分子质量分布，以确定该产物的特征。

图3 玉米蛋白水解物的分子量分布图

表3 玉米蛋白水解物分子质量分布表

如图3和表3所示，玉米蛋白酶解物的分子质量集中在63～3 548 u，此肽段面积占90%以上，其中分子量＜1 295 u的肽含量最多，约占80%，以2～10肽为主。

3 结论

非水相中固定化酶对玉米蛋白进行酶解所得的玉米小肽类物质具备较好的醒酒活性。在体外试验中，玉米肽对ADH及对ALDH活力均有促进作用，当控制水解度最高为22.7%时，玉米肽对ADH和ALDH的激活作用最高，达27.1%、50.0%。非水相中制备的玉米小肽类物质含有较高比例的Ala、Leu及Pro，尤其是Leu含量，酶解产物以2～10肽为主。

若能进一步提高固定化酶的活力，提高非水相中玉米蛋白的酶解效率，将对醒酒多肽的制备提供一条新颖高效的途径。

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Preparation of Corn Peptide in Nonaqueous Media and Its Antialcoholism Activity in vitro

Wu Hui，Li Li-li，Li Xiao-feng，Yu Yi-gang
(College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)

Crude corn peptides were prepared via immobilized enzymatic hydrolysis of corn proteins in nonaqueous media，and its alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activities in vitro were studied.Amino acids composition and relative molecular weight distribution of the peptides were analyzed.Results showed that the highest alcohol dehydrogenase and acetaldehyde dehydrogenase activation ratio were 27.1%and 50.0%，respectively，when the hydrolysis degree reached 22.7%.Corn peptides contained high proportion of alanine，praline and leucine，especially leucine.Molecular weight of enzymatic hydrolysis products were less than 3 548 u，the most were below 1295 Da，taking up about 80%，mainly be 2～10 peptides.

nonaqueous media，immobilization，corn peptides，antialcoholism activity

博导，教授(李晓凤为通讯作者)。

*国家自然科学基金项目(20906031)，教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET－060746)，教育部高校博士点专项科研基金(200805611022)

2009－12－07，改回日期:2010－05－21