松香基功能高分子稀土离子配合物固定化糖化酶

袁 霖,卢建芳,雷福厚,,段文贵

（1.广西大学化学化工学院,广西南宁530006;2.广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁 530006）

松香基功能高分子稀土离子配合物固定化糖化酶

袁 霖1,卢建芳2,雷福厚1,2,段文贵1

（1.广西大学化学化工学院,广西南宁530006;2.广西民族大学化学与生态工程学院,广西南宁 530006）

分别以聚马来松香己二醇酯（PM HE）、马来松香丙烯酸乙二醇酯聚合物（PMAGE）和马来松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[Poly（MAGE2AA）]为载体,以 Y3+为桥键配离子固定化糖化酶,并测定了固定化糖化酶的性能。结果表明,Poly（MAGE2AA）Y En固定化酶的性能较好,最适温度为50℃,比游离酶高出10℃;最适p H值为5.01;重复使用5次后,活性为1888.00 U·g-1,说明固定化糖化酶的稳定性增强。

松香基功能高分子;糖化酶;固定化酶;稀土离子

葡萄糖淀粉酶[Glucoam ylase,E（3.2.1.3）]又称γ2淀粉酶,简称糖化酶（缩写 GA或 G）。糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶,主要用于水解淀粉、糊精、糖原等制备葡萄糖。葡萄糖是人体和动物体新陈代谢中不可缺少的营养物质,也是运动所需能量的重要来源。同时葡萄糖在医药、食品、制革及印染等工业也有着广泛的应用[1,2]。用酶法代替高压酸水解法生产葡萄糖是葡萄糖工业的重大突破,但由于游离酶存在着容易失活、不能回收、不易与产物分离、影响产品提纯与质量等缺陷,使得工业生产成本较高。酶经固定化后,不仅抗性增强、可重复使用,且易与产物分离,因而固定化糖化酶在工业生产中受到广泛关注[3～8]。

作者在此以天然可再生的松香为原料合成的聚马来松香己二醇酯（PM HE）、马来松香丙烯酸乙二醇酯聚合物（PMAGE）和马来松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[Poly（MA GE2AA）]三种树脂作载体,以稀土离子 Y3+为桥键配离子固定化糖化酶,并测定了其耐热性、耐酸碱性、重复使用性。松香基功能高分子稀土离子配合物固定化酶模型见图1。

图1 松香基功能高分子稀土离子配合物固定化酶模型Fig.1 Model of immobilized enzyme on rosin based functional polymer2rare earth ion complexes

1 实验

1.1 试剂与仪器

糖化酶,北京奥博星生物技术有限责任公司;可溶性淀粉,北京试剂厂;葡萄糖、酚酞,中国医药集团上海化学试剂公司;36%乙酸、硫酸酮、四水合酒石酸钠、硫代硫酸钠,广东汕头市西陇化工厂;无水乙酸钠,广东台山化工厂;碘化钾、氢氧化钠,国药集团化学试剂有限公司;浓硫酸,廉江市爱廉化试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。

SYC215型超级恒温水浴,南京桑力电子设备厂。

1.2 方法

1.2.1 松香基功能高分子的合成

1.2.1.1 PM HE树脂

取30 g马来松香和11.5 g己二醇（摩尔比1∶1.3）置于250 mL装有分水器及回流冷凝管的三颈瓶中,加入1.2 g对甲苯磺酸、100 mL汽油与1,42二氧六环（体积比为5∶1）,加热,130～140℃下搅拌反应30 h。反应结束后分离上层溶剂,用60～70℃的蒸馏水反复洗涤,干燥。产品再用环己烷回流6 h,干燥,得到聚马来松香己二醇酯[9]。

PM HE树脂的软化点为 278℃,酸值为 21 m g KOH·g-1,交联度为75%,平均孔径为300。

1.2.1.2 PMAGE树脂

（1）取30 g研细的马来松香于装有温度计、分水器、搅拌器和回流冷凝管的250 m L三颈瓶中,加入80 m L汽油、2 g对甲苯磺酸、20 m L乙二醇、15 mL甲苯。加热,在130℃反应3 h。停止加热,趁热分离上层溶剂,用80℃的去离子水反复洗涤产物,放入烘箱干燥,得到马来松香乙二醇酯。

（2）取40 g干燥的马来松香乙二醇酯置于装有温度计、分水器、搅拌器和回流冷凝管的250 mL三颈烧瓶中,加入35 mL丙烯酸、2 g对甲苯磺酸、1.2 g对苯二酚、120 mL汽油。加热,温度从118℃缓慢升到140℃,直到没有水分分出为止,趁热分离上层溶剂,用80℃的去离子水反复洗涤产物,得到马来松香丙烯酸乙二醇酯。

（3）取15 g马来松香丙烯酸乙二醇酯置于装有温度计、分水器、搅拌器和回流冷凝管的250 mL三颈瓶中,加入100 m L汽油。加热,温度升到70℃时加入1.2 g偶氮二异丁腈,继续升温到85℃,反应2 h。停止加热,冷却,抽滤,得聚马来松香丙烯酸乙二醇酯。

PMAGE树脂的软化点为320℃,酸值为54.3 mg KOH·g-1,交联度为67%,平均孔径为24。

1.2.1.3 Poly（MAGE2AA）树脂

称取30 g马来松香丙烯酸乙二醇酯、1.0 g偶氮二异丁腈、1.0 g丙烯酸放入溶剂中,超声溶解,使之分散充分。反应烧瓶中加入200 m L去离子水,升温至60～70℃,将有机相倒入烧瓶中,在80～90℃搅拌反应2 h,冷却,抽滤,烘干,得马来松香丙烯酸乙二醇酯-丙烯酸共聚物[10]。

Poly（MAGE2AA）树脂的软化点为252℃,酸值为59.8 mg KOH·g-1,交联度为60%,平均孔径为250。

1.2.2 固定化糖化酶的制备

取 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2AA）三种树脂在 Y3+溶液中回流7 h,立即取出冷却,倾倒溶液,洗涤,得聚合物稀土离子配合物。取粒度均匀的配合物放置在酶溶液中浸泡,置于冰箱（约5℃）中48 h,过滤,洗涤,用滤纸吸干树脂,5℃保存备用。

1.2.3 固定化糖化酶活力的测定

酶活性测定参照D IAZYM E酶活测定法[11,12]。

2 结果与讨论

2.1 固定化糖化酶的重复使用性

将各种固定化糖化酶同时置于恒温槽中,在相同温度下恒温1 h,测定酶活,然后用蒸馏水洗涤,再测定酶活,重复5次,以某一单位时间内生成的最大葡萄糖量活性表示为100,用第n次单位时间内生成的葡萄糖量与最大葡萄糖量的比值表示固定化酶的相对活性。结果见表1。

表1 Y3+为配离子的固定化糖化酶的重复使用性Tab11 Repeated usability of immobilized glucoamylase using Y3+as bridging ion

由表1可知,没有中间桥键离子的PM HE固定化酶重复使用第3次时,已完全失活,且最大酶活性为871.40 U·g-1。而以 Y3+为桥键配离子的PM HE固定化酶重复使用5次后,酶活性仍达1271.40 U·g-1。这可能是因为未固定有稀土离子的树脂与糖化酶是以较弱的分子间力结合的,易被破坏。而固定有稀土离子的树脂与糖化酶是以较强的配位键连接的,不易断裂。因此,有稀土离子作为中间桥的树脂固定化糖化酶效果较好。

2.2 温度对游离糖化酶和固定化糖化酶的影响

分别将以 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2AA）为载体、以Y3+为桥键配离子的固定化糖化酶及游离糖化酶置于恒温槽中,在不同温度下恒温1 h后测定酶的相对活性,结果见表2。

表2 温度对游离糖化酶和固定化糖化酶相对活性的影响Tab12 Effect of temperature on relative activity of free glucoamylase and immobilized glucoamylase

由表2可知,三种固定化酶最适宜温度均为50℃,比游离酶高出10℃。这可能是由于载体包裹着酶,减少了酶与底物的接触,随着温度的升高,载体溶胀开,更多的酶能与底物充分接触,酶的活性不断增大,直至最大值;当温度继续升高时,酶会变性,反而使其活性降低。

2.3 p H值对游离糖化酶和固定化糖化酶的影响

选择目数均匀的固定化糖化酶和游离糖化酶同时置于恒温槽中,考察p H值对固定化糖化酶和游离糖化酶的相对活性的影响,结果见表3。

表3 pH值对游离糖化酶和固定化糖化酶相对活性的影响Tab13 Effect of pH value on relative activity of freeglucoamylase and immobilized glucoamylase

由表 3可知,Poly（M AGE2AA）YEn、PM AGEY En固定化糖化酶的最适p H值为5.01,与游离糖化酶最适宜p H值6.01比较,向酸性方向移动了1个单位。这可能是因为不同配离子使得固定化酶的耐酸碱性发生了移动;且底物、配体和氢离子浓度在树脂配离子载体附近和本体溶液之间分布得不均匀,载体周围的局部浓度和整体溶液浓度不同,即酶的微环境发生变化,也导致最适宜p H值向低p H值移动。

2.4 松香基功能高分子配位键法固定化糖化酶构效关系

分别取一定量 PM HE、PMAGE、Poly（MAGE2 AA）3种树脂与 Y3+配位生成配合物,用蒸馏水洗涤,洗涤后的树脂高温焙烧,再用浓 HCl/浓 HNO3混合酸将焙烧后的剩余氧化物消解,配成50 m L溶液,用ICP测定溶液中 Y3+的含量,结果见表4。

表4 不同树脂的Y3+吸附量/mmol·g-1Tab14 The adsorption quantity of Y3+by different resin

由表4可知,PM HE、PMAGE和 Poly（MAGE2 AA）树脂对 Y3+的吸附能力大小依次为：Poly（M AGE2AA）>PMA GE>PM HE,这是由于松香基功能高分子的酸值、微孔面积和孔径共同影响的结果。建立松香基功能高分子吸附金属离子量与其孔径、酸值及微孔面积的关系式为：

式中：m0表示松香基功能高分子吸附金属离子物质的量;k0表示吸附常数;S表示微孔面积;j表示功能高分子的酸值;d表示功能高分子的孔径。

PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PM HE的微孔面积（m2·g-1）分别为 5.8056、3.3751、3.3547;酸值（mg KOH ·g-1）分别为 54.3、59.8、21;分子孔径（A。）分别为 24、250、300;S·j·d1/3值分别为 909、1254、472。因此,Poly（MAGE2AA）树脂吸附效果最佳,PMAGE树脂次之,PM HE树脂最差。

以 PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PM HE 为载体、以Y3+为桥键配离子的固定化糖化酶的活性大小依次为：Poly（MAGE2AA）YEn>PM HEYEn>PMAGEYEn。这是树脂的微孔面积和酸值共同作用的结果：树脂的酸值越大,树脂与金属离子配位越多,载体连接上的酶越多;同时树脂的微孔面积越大,与酶分子接触的几率越大,载体配位连接上的酶越多。建立固定化酶的活性与功能高分子载体微孔面积和酸值的关系式为：

式中：△U表示固定化酶的活性;k表示活性常数;S表示微孔面积;j表示功能高分子的酸值;d表示功能高分子的孔径。

PMAGE、Poly（MAGE2AA）、PMHE的S·j·d值分别为 7566、50 457、21 134。因此,以 Poly（MAGE2AA）为载体的固定化糖化酶活性最佳,PMHE为载体的次之,PMAGE为载体的最差。

对比式（1）和式（2）可知,功能高分子孔径对树脂吸附离子能力的影响要小于其对固定化酶活性的影响。这是因为,功能高分子吸附离子时,离子较小,较易进入树脂孔径内部与内部的-COOH结合,故孔径对树脂吸附离子量影响较小;而酶分子量很大,空间结构大,与松香基功能高分子离子配合物发生配位生成固定化酶时,酶分子很难进入高分子内部,仅在其表面发生反应,高分子孔径越大,越利于酶分子进入孔内部,因此,高分子孔径大小对酶分子在载体上的固定影响较大。据此,可以设计更理想的固定化酶功能高分子载体。

3 结论

采用天然可再生的松香为原料合成的树脂为载体,以稀土离子 Y3+为桥键配离子固定化糖化酶,其中Poly（MAGE2AA）YEn固定化酶的性能较好,最适温度为50℃,比游离酶高出10℃;最适p H值为5.01,重复使用5次后,活性为1888.00 U·g-1,说明固定化糖化酶的稳定性增强。进一步探索了松香基功能高分子配位键法固定化糖化酶构效关系,为固定化酶载体的设计提供了理论依据。

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Immobilization of Glucoamylase by Rosin Based Functional Polymer2Rare Earth Ion Complexes

YUAN L in1,LU Jian2fang2,LEIFu2hou1,2,DUANWen2gui1
（1.College of Chem istry and Chem ical Industry,Guangxi University,N anning530006,China;2.College of Chem istry and Ecological Engineering,Guangx i University for N ationalities,N anning530006,China）

Immobilized glucoamylase were p repared by using polymer of maleated rosin acid2hexandiol ester（PM HE）,copolymer of maleated rosin acid2acrylic acid2glycol ester2acrylic acid[Poly（MAGE2AA）]and poly2 mer of maleated rosin acid2acrylic acid2glycol ester（PMAGE）as carriers and themethod of rare earth ion coor2 dination.The performances of the immobilized enzymes were determined.The result showed that the highest activity was observed for the Poly（MAGE2AA）YEn.The op timal temperature and p H value w as 50℃and 5.01,respectively.The immobilization enzyme activity was 1888.00 U·g-1after used for 5 cycles.It p roved that the stability of immobilized glucoam ylase w as increased.

rosin based functional polymer;glucoamylase;immobilized enzyme;rare earth ion

Q 814

A

1672-5425（2010）06-0062-04

广西科学研究与技术开发基金资助项目（桂科攻08395003-9）

2010-03-18

袁霖（1984-）,男,湖南永州人,硕士研究生,研究方向：天然产物开发与应用;通讯作者：雷福厚,教授。E2mail：leifuhou@163.com。