柿叶挥发油抑菌活性的研究

陈 静 ，赵丰丽，周巧劲

（广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004）

柿叶挥发油抑菌活性的研究

陈 静 ，赵丰丽，周巧劲

（广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004）

采用水蒸气蒸馏法提取柿叶挥发油，并用滤纸片法研究柿叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌活性和最低抑菌浓度. 结果表明，柿叶挥发油对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，而对大肠杆菌抑制作用较弱，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度分别为3.13µL/m L、3.13µL/m L和25.00µL/m L. 柿叶挥发油较好的抗微生物活性表明它可能是一种较好的临床抗菌药物.

柿叶挥发油；抑菌活性；最低抑菌浓度

柿叶为双子叶柿树科柿树属柿(Diospyros kaki L. f.)的叶. 柿树为常绿或落叶乔木或灌木，主要生长在热带和温带，约有6属450种，其中我国有柿树2属50多种，栽培面积约2.0×105hm2，产量占世界总产量的50%以上，是世界上最主要的柿树生产国. 柿树在我国已有2 000多年的栽培历史，也是我国重要的经济树种之一. 柿叶中含有丰富的维生素C、黄酮、芦丁、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体有益的营养成分，具有较高的营养价值和医疗保健作用. 目前，我国柿叶开发的产品种类较少，品质低. 最成功的是在柿叶茶制备技术的研究上. 关于柿叶化学成分的研究报道较少，其挥发性成分的研究国内外更少有报道，而且主要集中在挥发油提取工艺和化学成分分析研究上[1-5]，而对其抗菌活性的研究几乎未见报道. 通常植物中所含的精油都具有良好的抗虫、抑菌生物活性[6]. 本试验通过水蒸气蒸馏法提取柿叶挥发油，并采用滤纸片法对其抗菌活性进行了研究，旨在为充分利用我国柿叶资源，进一步研究和开发柿叶精油提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 柿叶

5月初至7月的新鲜柿叶，采自桂林市郊区.

1.1.2 供试菌种

大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis). 广西师范大学发酵工程实验室提供.

1.1.3 主要试剂

石油醚(沸程30~60℃℃)、乙醚、无水硫酸钠、氯化钠等均为分析纯.

1.1.4 主要仪器

水蒸气蒸馏装置(自组装)；旋转蒸发仪(RE-52AA 中国上海亚荣仪器厂)；循环水式多用真空泵(SHB-B95中国郑州长城科工贸有限公司)；电子天平(BL12德国赛多利公司)；手提式压力蒸汽灭菌锅(YXQ-SG41-280B中国上海华线设备公司)；超净工作台(SW-CY-2F中国上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；生化培养箱(HP400S中国武汉瑞华仪器设备有限公司)；光学显微镜(YS100日本尼康公司).

1.2 方法

1.2.1 柿叶挥发油的提取

采用水蒸气蒸馏法，选用无虫无锈斑的新鲜柿叶，洗净、切碎，取500g放入3000m L烧瓶内，加水至1/2高处(约为1500m l)使柿叶完全浸透后进行蒸馏，蒸至溜出物无味为止. 蒸溜物中加入石油醚萃取三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠除去萃取液中的水，过滤，减压浓缩除去石油醚得到黄绿色透明油状物，有较浓的清香味，即为柿叶挥发油. 重复实验多次提取以制得足够量的柿叶挥发油，然后将制得的柿叶挥发油密闭保存，备用.

1.2.2 柿叶挥发油的抑菌试验

1.2.2.1 培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基(培养细菌用)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，水1000m L，调pH7.0~pH7.2，121℃，灭菌20m in备用.

1.2.2.2 菌悬液的制备

将三种供试菌活化，然后将一种菌挑取少量放入装有10m L无菌水的试管中，充分混合，制成菌悬液，用无菌吸管取1m L充分混合的菌悬液于另一支装有9m L无菌水的试管中，如此成10倍地稀释，依次制成系列浓度的菌悬液，按照同样的方法将另两种菌也依次制成系列浓度的菌悬液，采用平板记数法调至浓度为106~ 107个/m L的菌悬液，备用.

1.2.2.3 抑菌活性的测定(滤纸片法)

选用吸水力较强而质地均匀的滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形滤纸片，置干燥干净的培养皿中灭菌后备用. 将制得的柿叶挥发油以乙醚为溶剂配制成200.00µL/m L的待测液，取已灭菌的圆形滤纸片浸泡在待测液中30m in. 将融化的灭菌培养基倾入无菌培养皿中待凝固后将各种待测菌悬液各取0.3m L在相应的固体培养基上均匀涂布，制成含菌平板，用无菌镊子取浸泡过柿叶挥发油待测液的滤纸片，沥干后贴在含菌平板上，轻压一下，使其牢固. 每皿放三片，其中一片为只浸有乙醚的滤纸片做为对照，另外两片为浸泡过200µL/m L待测液的滤纸片，每种菌做两个平皿，然后置于培养箱中37℃下培养24h后测定抑菌圈直径，实验结果取平均值[7-12].

1.2.2.4 最低抑菌浓度的测定

能够完全抑制某真菌或细菌生长的最低浓度为该菌种的最低抑菌浓度(M IC)[13]. 根据滤纸片法所得的结果，采用2倍连续梯度稀释，以乙醚为溶剂将200.00μL/m L柿叶挥发油溶液依次配制成100.00μL/m L，50.00μL/m L，25.00μL/m L，12.50μL/m L，6.25μL/m L，3.13μL/m L，1.56μL/m L，0.78μL/m L，0.39μL/m L和0.19μL/m L的10种浓度梯度试样液，将灭菌后的滤纸片分别浸泡在10不同浓度的挥发油试样液中30min. 将三种待测菌悬液各取0.3m L在相应的固体培养基上均匀涂布，制成含菌平板，然后将在10种浓度稀释液中浸泡好的滤纸片取出沥干贴在含菌平板上，轻压一下使其牢固，每皿贴三片，其中一片为乙醚对照，每种浓度每种菌做两个平皿，然后倒置于培养箱中于37℃培养24h后观察现象，出现抑菌圈的最低药物浓度即为MIC值[14].

2 结果与分析

2.1 抑菌活性试验结果

按照1.2.2.3 抑菌活性的测定方法(滤纸片法)进行抑菌试验，试验结果见表1.

表1 抑菌活性测定结果

表1结果显示，200.00µL/m L的柿叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均具有抑制作用. 其中对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌的抑制作用次之，其抑菌圈平均直径分别为18.5mm和15.5mm；而对大肠杆菌的抑制作用最弱，其抑菌圈直径为9.2mm.

2.2 M IC试验结果

由抑菌活性试验结果可以看出柿叶挥发油对三种供试菌都有抑菌效果，为进一步证实其抑菌活性，按照1.2.2.4最低抑菌浓度的测定方法，测定柿叶挥发油对三种供试菌的最低抑制菌浓度，试验结果见表2.

表2 M IC测定结果

表2结果显示，柿叶挥发油对大肠杆菌的M IC为25.00µL/m L，对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的M IC都为3.13µL/m L. M IC试验结果说明，柿叶挥发油对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用，在其浓度为3.13µL/m L时有抑制圈出现，即具有抑制作用；而对大肠杆菌的抑制作用较弱，在其浓度为25.00µL/m L时有抑制圈，而当浓度为12.50µL/m L时已不出现抑制圈，即已不具有抑制作用.

3 结语

柿叶挥发油抑菌试验表明，柿叶挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌均具有抑制作用，

特别是对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制作用，在其最低抑菌浓度为3.13µL/m L时仍具有抑制作用，而对大肠杆菌的抑制作用较弱，其最低抑菌浓度为25.00µL/m L. 由于柿叶挥发油提取率较低，制得的柿叶挥发油量很少，所以本试验只对文中三种供试菌的抑菌活性做了研究，而对其他细菌和真菌的抑菌活性还有待进一步研究. 柿叶挥发油较好的抗微生物活性表明它可能是一种较好的临床抗菌药物. 根据文献[1]可知，柿叶挥发油的成分多为烯醇和烯醛类，推测其抑菌作用可能与其抗氧化活性具有密切联系，

具体抑菌机理还有待研究. 目前抗生素的耐药性日趋严重，寻找新的天然抗菌药物迫在眉睫，而我国柿叶资源丰富，大力开发柿叶精油卫生、保鲜应用产品前景良好.

[1] 安秋荣, 郭志峰. 柿叶挥发成分的GC/MS分析[J]. 河北大学学报: 自然科学版, 1999, 19(3): 256-259.

[2] 纪莉莲, 张强华, 崔桂友. 柿叶抗菌活性的研究及活性成分的分离鉴定[J]. 食品科学, 2003, 24(3): 129-131.

[3] 柯范生, 林娇芬, 林河通. 安溪油柿叶的营养成分分析与评价[J]. 包装与食品机械, 2009, 27(1): 26-28.

[4] 林娇芬, 林河通, 谢联辉, 等. 柿叶的化学成分、药理作用、临床应用及开发利用[J]. 食品与发酵工业, 2005, 31(7): 90-96.

[5] 张 颖, 岳 红, 赵晓丽. 水蒸气蒸馏法提取柿叶精油的工艺研究[J]. 林产化工通讯, 2004, 38(6): 26-29.

[6] 徐汉虹. 杀虫植物与植物性杀虫剂[M]. 北京: 中国农业出版社, 2001: 108, 120-122, 127.

[7] 蔡建秀, 尤祖卿, 黄晓冬, 等. 天竺桂挥发油化学成分及抑菌活性研究[J]. 热带亚热带植物学报, 2006, 14(5): 403-408.

[8] 高 莉, 斯拉甫·艾白, 韩阳花. 小茴香挥发油化学成分及抑菌作用的研究[J]. 中国名族医药杂志, 2007(12): 67-68.

[9] 刘 芳, 曾郑祥, 李仲芳. 峨眉含笑精油抑菌作用研究[J]. 安徽农业科学, 2008, 36(10): 4074-4075.

[10] 唐裕芳, 张妙玲, 陶能国, 等. 苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究[J]. 西北植物学报, 2008, 28(3): 0588-0594.

[11] 李 伟, 封 丹, 陆占国. 黑龙江产芫荽籽精油成分及其抗菌活性[J]. 中国调味品, 2008(1): 42-45.

[12] 弭向辉, 龚祝男, 张卫明, 等. 花椒挥发油的提取、分离和抗菌实验[J]. 南京师大学报: 自然科学版, 2004, 27(4): 63-66.

[13] 王立宽, 郭冬青, 李 军, 等. 荔枝草挥发油的化学成分分析及抑菌活性研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(27): 13094-13096.

[14] 李希红, 陈 荣, 纪付江. 剑叶金鸡菊挥发油的抗菌活性研究[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(23): 10996-10998.

Antim icrobial Activities of Volatile Oil from Persimmon Leaves

CHEN Jing, ZHAO Feng-li, ZHOU Qiao-jin
(College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)

The volatile oil was extracted from persimmon leaves by water steam distillation. Its antimicrobial activities and the m inimum inhibitory concentration(M IC)to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Escherichia coli were investigated by the filter paper method. The result showed that the volatile oil from persimmon leaves had powerful inhibitory effects against Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis, but it had weak inhibitory effects against Escherichia coli. The M IC to Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis and Escherichia coli were: 3.13 µL/m L, 3.13 µL/m L and 25.00 µL/m L, respectively.

Persimmon leaves volatile oil; Antim icrobial activities; M inimum inhibitory concentration (M IC)

Q949.96

A

1009-2854(2010)11-0034-03

(责任编辑：徐 杰)

2010-09-22

陈 静(1980— ), 女, 湖北襄樊人, 广西师范大学生命科学学院助教.