高血糖大鼠蓝斑核神经原一氧化氮合酶的改变

孙永杰

高血糖大鼠蓝斑核神经原一氧化氮合酶的改变

孙永杰

目的观察高血糖大鼠蓝斑核NOS阳性反应物的变化。方法用腹腔注射四氧嘧啶法建立高血糖大鼠动物模型。用酶组织化学和图像分析方法观察大鼠蓝斑核NOS细胞的变化。结果高血糖大鼠蓝斑核NOS细胞阳性反应物减弱(P＜0.01)。结论NOS阳性反应物减少与高血糖的发生、发展有关。

高血糖;蓝斑核;一氧化氮合酶;大鼠

一氧化氮是一种神经递质，也是一种重要生理功能的信使分子，既溶于水又溶于脂，是非常活跃的化学物质，参与多种生理过程。一氧化氮系在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下由L-精氨酸氧化产生，一氧化氮合酶是一氧化氮合成的关键因素［1］，广泛存在于中枢神经系统。目前，已有许多研究表明，蓝斑核所含去甲肾上腺素能神经元群，通过上、下行投射，几乎终止于全脑和脊髓灰质各部，从而影响脑的整体活动，如:控制注意力水平;调节觉醒-睡眠周期;参与胃肠道和呼吸道反射;参与介导所在网状结构的心血管、血压和化学感受器反射，并对痛觉传递进行调制等［2］。但关于高血糖时蓝斑核内NOS的含量是否发生改变尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 实验材料 雄性Wistar大鼠(中国医科大学动物室提供)，NADPH-d、四硝基唑蓝(NBT)、TritonX-100(购于 Sigma

公司);四氧嘧啶(购于Sigma公司);LUZEX-F显微图像分析仪(日本，松下公司);日立H-600透射电镜。

1.2 实验动物分组 本实验选用雄性Wistar大鼠40只，体质量260～300 g，随机分成2组。正常对照组:20只。实验组:20只。

1.3 实验方法

1.3.1 高血糖大鼠模型制备 实验动物禁食12 h。实验组腹腔一次注射200 mg/kg四氧嘧啶，正常对照组注射等体积的0.9%氯化钠注射液。6周后取材。

1.3.2 组化标本制备 对实验动物用1%戊巴比妥钠(40 ml/kg)腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1%肝素钠的0.9%氯化钠注射液500ml，同时剪开右心耳。继用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的大脑组织，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中进行后固定大约2 h，之后将实验动物的大脑组织切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20 μm。经OCT包埋，恒冷箱连续切片，片厚16 mm，-70℃保存备用。

1.3.3 尼氏染色 冰冻切片吹干，经PBS漂洗5min×3次，将切片置入1%甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90min，取出后用蒸馏水冲洗，PBS漂洗5min×3次，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.3.4 一氧化氮合酶组织化学方法 染色方法:NOS酶组织化学染色:在2 g/LTritonX-100磷酸缓冲液中预孵育5～10 min(室温);在下列孵育液中反应2 h(37℃):NADPH-d 10 mg，四硝基唑蓝(NBT)5 mg ，TritonX-100 0.03 ml，用0.1 mol/L PBS新鲜配制成100 ml;用PBS终止反应、漂洗;梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS11.5软件包进行统计分析，计量资料采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尼氏染色结果 正常对照组大鼠蓝斑核区的尼氏染色切片上，神经元数量较多，排列紧密，形态完整，泡浆内尼氏体丰富。实验组，正常神经元数量减少，细胞皱缩，有的溶解成碎片。

2.2 NOS酶组化结果 正常对照组和实验照组NOS阳性反应物分布于蓝斑核，多为锥体细胞，阳性反映物呈深兰色，分布在细胞质及突起，胞核不着色。实验组，NOS阳性细胞数量减少，其形态不同于正常NOS阳性细胞，细胞小，突起少，着色浅且大部分局限于细胞膜。见图1。

图1 高血糖大鼠蓝斑核区单位面积NOS阳性物平均灰度值

3 讨论

目前已知NOS有二类:原生型NOS(cNOS)和诱导型(iN-OS)［3］。在生理状态下cNOS参与各种活动的调节，其作用时间短，生成的一氧化氮少。iNOS在正常生理状态下表达较少，但在病理状态下，经某些细胞因子和内毒素等的诱导，表达增多，iNOS的作用时间长，可催化产生大量的一氧化氮。在实验中，我们观察到，大鼠蓝斑核NOS酶反应阳性细胞及纤维数量显著减少，结果提示NOS可能参与高血糖的病理生理过程，可作为神经元受损的标示物。

［1］ Bolanos JP，Almeida A.Roles of nitric oxide in brain hypoxiaischemia.Biophys Acta，1999，1411:415-436.

［2］ 柏数令.系统解剖学.人民卫生出版社，2008:345.

［3］ Carthwoite J.Clutamate，nitric oxide and cell-cell signalling in the nervous system.Trends Neurosci，1991，14:60-67.

Investigation on the change of nitric oxide synthetase positive neurons in locus ceruleus of rats with hy-perglycemia

SUN Yong-jie.
Liaoning Health College of Vocational Technology Shen Yang 110101，China

ObjectiveTo observe the expression of nitric oxide synthetase(NOS)in Locus Ceruleusneurons with hyperglycemia.MethodsNADPH-d histochemical method was used.ResultsNOS positive neurons expressed in Locus Ceruleus and nomal neurons of 6 weeks old rats with hyperglycemia(DM)and normal rats(NC).There was significant difference in neurons between DM group and control group.ConclusionThere is a relationNOS positive neurons decrease in Locus Ceruleus of rats with hyperglycemia.

Hyperglycemia;Locus ceruleus;NOS;Rat

110101辽宁卫生职业技术学院

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