实用的快速骨组织脱钙法

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(右江民族医学院形态学实验教学中心,广西 百色 533000 E-mail：78477503@qq.com)

脱钙是骨组织切片最常用的技术,传统的脱钙方法所需时间较长,短则3～4天,长则1～2个月,大大影响工作效率,也影响制片的质量。常用的快速脱钙法用戊二醛等试剂加强渗透力来加快脱钙速度,但很容易破坏骨组织的结构。如果在加戊二醛之前先用足够量的甲醛固定骨组织,既可以缩短脱钙时间又可以保护骨组织的结构,保证了切片质量。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 材料和试剂 教学、科研所用的大、小鼠和兔的股骨,蒸馏水,浓盐酸(36%～38%),甲酸(99%),冰醋酸,饱和的苦味酸溶液,磷酸二氢钠,磷酸氢二钠,甲醛溶液,戊二醛(25%)。

1.2 方法

1.2.1 固定 用Bouin,固定时间2.5h。

1.2.2 脱钙 甲溶液：蒸馏水60ml加浓盐酸(36%～38%)9ml加甲酸溶液6ml加磷酸氢二钠5g加磷酸二氢钠1g配制待用;乙溶液：甲醛溶液10ml;丙溶液：25%戊二醛15ml。脱钙时甲、乙和丙三种溶液临时按 75ml∶10ml∶15ml混合后作为脱钙工作液使用。取标本约1.5cm×1.5cm×0.3cm的小块便于脱钙,脱钙时最好用广口瓶,敞开瓶口,随时观察脱钙情况,标本要分散,聚集和紧贴瓶底都会影响脱钙的速度。室温控制在37℃左右便于脱钙,温度过高试剂易挥发,温度过低脱钙的速度减慢。脱钙工作液换1～2次,时间约为4h。脱钙终点的检测：标本脱钙不足易于损伤切刀,组织切片也易于碎裂,标本脱钙过度对组织结构是不可逆的损害,所以要及时准确判断脱钙终点。脱钙终点的检测有化学方法和物理方法,化学方法准确但比较烦琐,物理方法比较简单但易损伤组织结构。化学检测脱钙终点所需要的是5%的氢氧化铵储存液(蒸馏水95ml加28%氢氧化铵5ml)和5%的草酸铵储存液。检测时用5%的氢氧化铵储存液和5%的草酸铵储存液按1∶1配制检测工作液。检测时把吸管插入正在进行脱钙含有样本的脱钙液中,从脱钙瓶的底部吸取3ml脱钙液,装入一干净的试管,再加入6ml氢氧化铵/草酸铵工作液,静放置30min无沉淀说明脱钙完全,如有沉淀应换脱钙工作液,继续脱钙直至检测无沉淀为止。物理检测方法,可轻度弯曲标本、细针插入标本和用刀片切割,易弯曲、插入或切割说明脱钙完全。经严格检查脱钙完全后,组织块应充分冲洗,按常规进行脱水、透明、包埋、切片和染色。

2 结果

标本用改良快速骨组织的脱钙法处理后切片质量良好,切片完整,切片厚度可达3～4 μ m,染色时切片不易脱落,骨组织结构完整,镜下观察骨密质着色均匀,骨陷窝清楚,骨细胞核染色清晰,对比鲜明,胞浆界限清楚。骨松质纹理清楚,人为断裂、缺损少。骨髓腔的各种细胞染色分明,细胞边界清晰。此脱钙法处理后切片效果良好(见图1)。

图1 快速脱钙法骨切片效果图

3 讨论

传统的脱钙方法是将标本取好材固定后直接放入稀酸溶液中进行脱钙[1],脱钙时间短则需要24h,长则需要几天,甚至几个月,而本方法仅需要3～4h。传统的脱钙方法经脱水包埋后,切片厚度较厚,常在5μ m以上,而且切片染色时组织易出现脱落现象[2]。如脱钙时间掌握不好不仅损坏刀刃,还会破坏骨组织中的细胞学形态。此法脱钙,在脱钙液中加入甲醛可以在脱钙过程中进一步固定骨组织的结构免受酸的破坏,在脱钙液中加入戊二醛可以加大脱钙液的穿透力而加快脱钙速度[3]。本方法同时使用甲醛和小剂量的戊二醛,减少甲醛用量,降低组织块脆性,防止组织块的碎裂;减少戊二醛的用量,减轻对组织结构的破坏。所以此法脱钙既有保护组织的结构又能缩短脱钙时间从而使切片既快又好,节约时间和成本,值得推广。

[1]王伯,李玉松,黄高升,等.病理学技术[M].北京：人民卫生出版社,2001：944.

[2]赵洁,李霞,魏志敏,等.骨组织脱钙方法的改良[J].齐鲁医学杂志,2006,21(4)：356.

[3]李江涛.一种骨组织块速脱钙方法[J].陕西肿瘤医学,2001,9(4)：261.