广西巴马长寿人群ACE基因多态性与环境因素的交互作用

覃 健 何 敏 张志勇 黎湘娟 张 楠 于 佳 容敏华

(广西医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生教研室，广西 南宁 530021)

广西巴马长寿人群ACE基因多态性与环境因素的交互作用

覃 健 何 敏1张志勇 黎湘娟 张 楠 于 佳 容敏华

(广西医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生教研室，广西 南宁 530021)

目的 探讨血管紧张素转换酶(ACE)基因I/D多态性与环境因素在巴马地区长寿现象发生中的交互作用。方法 采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCR－RFLP)技术对广西巴马地区200例长寿老人(年龄90～110岁，长寿组)以及288例健康成年人(年龄48～89岁，对照组)的ACE基因进行基因分型。应用条件Logistic回归模型分析巴马长寿发生的环境及遗传因素，根据交互作用指标判断基因与环境的交互作用。结果 长寿区的环境因素及ACE基因的ID+DD基因型是巴马人长寿的促进因素，两者存在交互作用(OR=11.063，r=1.378)。结论 ACE基因I/D多态性与环境因素在巴马地区长寿现象发生中存在一定的交互作用，其长寿现象的发生是遗传及环境因素共同作用的结果。

血管紧张素转换酶;巴马地区;长寿;交互作用

人类血管紧张素转换酶(ACE)基因位于17号染色体长臂2区3带(17q23)，由26个外显子和25个内含子组成，属于单拷贝基因。在第16个内含子存在287 bp的Alu插入/缺失序列，形成 ACE I/D多态性。含有 Alu片段，PCR产物长度490 bp，为插入型(I型);没有此序列，产物长度190 bp，为缺失型(D型)。人类只有I、D两种等位基因，不同个体可构成3种基因型，即插入纯合型(II)、缺失纯合型(DD)及插入/缺失杂合型(ID)，且多态性等位基因的传递方式符合孟德尔遗传规律〔1，2〕。ACE 基因 I/D 多态性与人类寿命有关〔3～5〕。广西巴马县是世界著名的第五长寿之乡，为了探索巴马地区长寿现象，本研究采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术分析ACE基因该位点的多态性，探讨其基因多态性与环境有利因素的交互作用在巴马长寿发生中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究地点 广西巴马县平洞、西山、甲篆三个相连的石山区乡镇为巴马县长寿区，其百岁老人比例在巴马地区排名前三位(分别105/105、80/105、76/105)。与之一江之隔的那社、局桑两个土山区乡镇为巴马县非长寿区，其百岁老人比例在巴马地区排名最后两位(分别21/105、15/105)。

1.2 研究对象 在巴马地区选取长寿老人200例(90～110岁)为长寿组，其中177例来自长寿区，23例来自非长寿区。选取家族三代内无年龄＞90岁老人的健康对照者288例(48～89岁)为对照组，其中140例来自长寿地区，148例来自非长寿地区。

1.3 基因组DNA提取 根据“知情同意”的原则采集研究对象静脉血，EDTA 抗凝，采用 Chelex－100 法〔6〕制备血样 DNA。

1.4 ACE基因型检测

1.4.1 引物设计及合成 目前很多研究者采用Rigat法〔7〕，该方法由于PCR反应中D等位基因优先扩增，而导致I等位基因扩增无效，可能将ID基因型个体错误分类为DD型。已有研究〔8〕证实Rigat法的错判率为8%左右，但其错判的原因尚未明确。鉴于此原因，本研究参照周文华等〔9〕报道的基础上设计两对引物，采用PCR两步法，对上述PCR反应得到的DD型再用一对插入片段特异性引物进行第二次PCR反应，可降低DD基因型的错判率。

采用Oligo 6.0引物设计软件，第一条引物:上游引物为5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT －3′，下游引物为 5′－GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT－3′，产物为 490 bp、190 bp;第二条引物:上游引物为5′－TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA－3′，下游引物为 5′－TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAC TAC－3′，产物为337 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成提供。

1.4.2 PCR扩增 ①PCR反应体系:25 μl体系包括PCR mix 12.5 μl，引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，DNA 模板 0.5 μl，去离子水11.2 μl。②第一次PCR反应程序:95℃预变性5 min，94℃、64℃各1 min，72℃ 2 min，循环35 次，72℃延伸7 min。③第二次PCR反应程序:94℃、64℃各1 min，72℃ 2 min，循环35次，72℃延伸7 min。④2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察PCR产物结果。

1.4.3 基因分型 采用两对引物及两次PCR的方法。DNA样品经第一次 PCR扩增后，在凝胶成像系统下观察，可见490 bp和190 bp的DNA片段，构成3种基因型:仅有490 bp条带的为 II型纯合子;仅有190 bp条带的为 DD型纯合子;同时有490 bp和190 bp两个条带的为ID型杂合子。对上述PCR反应得到的DD型再用一对插入片段特异性引物进行第二次PCR反应，只有含I等位基因的DNA扩增产物才在337 bp处显示清晰条带。

1.5 统计学分析 采用直接计数法计算基因型及等位基因频率，等位基因频率 =(2×纯合子+杂合子)/(2×组别人数)。采用HWE软件分析研究对象的基因型频率与Hardy－Weinberg平衡的符合程度，应用SPSS13.0软件包进行资料分析，组间比较用χ2检验。应用条件Logistic回归模型对基因与环境的不同在巴马长寿中的交互作用进行分析，根据 Khoury〔10〕和Ottman〔11〕提出的2型交互作用模型(GEI)的交互作用系数(γ，γ=βeg/βe)判断交互作用存在与否以及基因－环境作用类型。①模型判定依据:OReg=ORe×ORg为相乘模型;OReg＞ORe×ORg为超相乘模型;OReg＜ORe×ORg为次相乘模型;OReg=ORe×ORg－1为相加模型。②交互作用判定依据:γ＞1，表示基因因素对环境暴露的效应有放大作用，正向交互作用;γ＜1，表示基因因素对环境暴露的效应有减弱作用，负向交互作用;γ=1，表示基因因素对环境暴露没有交互作用〔10～14〕。

2 结果

2.1 研究群体的性别比较分析 长寿组200例，男57例，女143例;对照组288例，男106例，女182例，长寿组与对照组的性别没有统计学差异(P＞0.05)。

2.2 研究群体的Hardy－Weinberg平衡检验 对长寿组、对照组及总体(长寿组+对照组)的ACE基因型进行Hardy－Weinberg平衡检验，均符合 Hardy－Weinberg平衡规律(P＞0.05)。表明选择的样本具有群体代表性，基因频率能代表群体的基因分布。见表1。

2.3 基因分型结果 在长寿组和对照组各发现了18、16例DD纯合型，83、92例ID杂合型，其余的均为II纯合型。见图1、图 2。

2.4 ACE基因多态性与巴马长寿的关联分析 与对照组比较，长寿组DD基因型和D型等位基因频率高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 研究群体ACE基因的基因型Hardy-Weinberg平衡检验

图1ACE基因(I/D)多态性的PCR产物电泳图

图2 ACE基因(I/D)多态性第16内含子插入特异性片段电泳图

表2 长寿组与对照组ACE基因型和等位基因频率比较

2.5 ACE基因各基因型、长寿区环境与巴马长寿的单因素回归分析 用单因素Logistic回归分析，与II基因型相比，携带ID+DD基因型的个体可能会长寿的可能性高于对照人群，OR值为1.7，提示携带ID+DD基因型的个体可能会增加寿限。与非长寿区环境相比，在长寿区环境生活的巴马人导致长寿的可能性高于对照人群，OR值为8.135，提示长寿区环境是巴马长寿的促进因素。见表3。

表3 ACE基因型因素、长寿区环境因素的单因素Logistic回归分析

2.6 ACE基因I/D多态性与环境因素的交互作用 分析ACE基因(I/D)多态性与长寿区环境因素对巴马人长寿的交互作用，单独暴露在长寿区环境 ORe值为 5.726(OR，95%CI 3.073～10.668)，单独携带非插入基因型ID+DD的ORg值为0.815(OR，95%CI 0.329～2.136)，说明长寿区环境和DD+ID基因型是促进长寿的因子。两者同时存在时，交互作用OReg值为11.063(OR，95%CI 5.809～21.068)，γ值为1.378＞1，表明长寿区环境和ID+DD基因型在巴马长寿发生中起正向交互作用，两者是协同作用，长寿区环境对ID+DD基因型在巴马长寿中的作用具有放大效应。OReg=11.063＞5.726×0.815，提示ACE非插入基因型与长寿环境交互作用机制在巴马长寿中为超相乘模型，两者共同存在时对巴马长寿的促进作用大于两者单独存在的作用的乘积。见表4。

表4 ACE基因I/D多态性、长寿区环境对巴马长寿的联合作用

3 讨论

人类长寿的原因极为复杂，总的来说应当有遗传因素、环境因素或二者的综合作用〔15〕。近年来一些双生子研究表明，大约25%的人类寿命的变异可以用遗传因素来解释〔16，17〕，也就是说大约75%的寿命变化是环境因素或者是遗传与环境因素交互作用的结果。世界上的长寿区大体可分为两种类型，一种是以经济高速发展、环境相对开放为特点的经济型长寿区，例如日本，这与当地较为发达的经济、较好的社会福利有关〔18〕。另一种是以经济欠发达、环境相对封闭为特点的自然型长寿区，如欧亚交界之处的高加索地区、中国新疆的和田、广西的巴马等。随着社会的进步和经济的发展，近年来一些经济发达地区的百岁老人明显增多。但迄今为止，世界上大多数长寿区仍以自然长寿区为主，说明自然环境对人类长寿的影响很大。同时也被认为是一些非特异性的因素，因为各个长寿地区往往还有其独特的环境特点，其中对土壤、饮水、作物及人体中微量元素与长寿关系的研究较多，人体中一些微量元素的含量和比值可能是长寿的特异性因素。上述研究表明，环境因素(包括膳食、社会和心理因素)可能是巴马人长寿的重要原因。

本课题组之前研究表明巴马县长寿老人存在明显的地区分布不均衡性，甲篆、平洞、西山三个乡长寿人口比例明显高于那社、局桑等乡镇，由此形成了甲篆、平洞、西山三个乡组成的“长寿集落区”，同时存在“非长寿集落区”，即那社、局桑等地。本研究即探讨巴马县内长寿集落区与非长寿集落区对巴马人长寿的影响及其与遗传因素对巴马人长寿的交互作用。

研究基因之间、基因与环境因子之间的交互作用的方法很多，其分析交互作用时各有优缺点，又相互优势互补。从分析方法上看，有叉生分析(crossover analysis)、多因素Logistic回归模型、多因子降维法(multifactor dimensionality reduction)和基于复合LD(composite linkage disequilibrium)交互作用分析方法。本研究采用Logistic回归模型。

用单因素Logistic回归分析ACE基因型及长寿区环境对巴马长寿的影响，与非长寿区环境相比，在长寿区环境生活的巴马人长寿的可能性高于对照人群，OR值为8.135，提示长寿区环境生活的巴马人可能会促进长寿。与II基因型相比，携带ID+DD基因型的个体长寿的可能性高于对照人群，OR值为1.7，提示携带ID、DD基因型的个体可能是长寿的有利因素。

应用交互作用模型理论，探讨ACE基因多态性与长寿环境的交互作用，结果发现ACE基因型ID+DD与长寿区环境有一定的正向交互作用，两者可能是长寿的促进因素。两者是协同作用，两者共同存在时，对巴马长寿的促进作用大于两者单独存在的作用的乘积。

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Interaction of ACE gene polymorphisms and environmental factors in longevity elderly in Bama of Guangxi

QIN Jian，HE Min，ZHANG Zhi-Yong，et al.
Department of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China

ObjectiveTo investigate the interaction of the environmental factors of the longevity district and ACE gene polymorphisms in Bama longevity.Methods Genotyping of ACE gene was performed by PCR－RFLP for 200 longevous people(aged 90 ～110)and 288 healthy controls(aged 48 ～89).All data were performed with statistics and logistic regression analysis by SPSS.Results The interaction and confounding among the factors were estimated，and there was a positive interaction between the ID+DD genotypes in ACE and the environment of the longevity district.Conclusions The environment of the longevity district would be closely correlated with human longevity in Bama county.The polymorphisms of ACE gene with the environment factor have a synergistic effect on longevity.The longevity of Bama may be the interaction of heredity and environment.

ACE;Bama county;Longevity;Interaction

R994.6

A

1005-9202(2011)12-2163-04

国家自然科学基金资助项目(No.30560166，No.81060246);广西科学基金资助项目(桂科基0639045，桂科自0991115桂科青0832032);广西科学研究与技术开发项目(桂科能0815011－6－5)

1 广西医科大学医学科学实验中心

张志勇(1963－)，男，教授，博士生导师，主要从事环境流行病学研究。

覃 健(1978－)，男，博士，主要从事环境流行病学研究。

〔2010－08－05 收稿 2010－10－28 修回〕

(编辑 张永贵/徐 杰)