N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮对血管性痴呆大鼠神经的保护作用

李杰茹 韩聚强 张利敏 赵国华 王 刚 (河北医科大学，河北 石家庄 05000)

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮对血管性痴呆大鼠神经的保护作用

李杰茹 韩聚强 张利敏1赵国华2王 刚1(河北医科大学，河北 石家庄 050200)

目的 观察N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)对血管性痴呆(VD)大鼠神经保护研究及其机制。方法 采用改良的二血管阻断+硝普钠法制备VD大鼠模型，术后随机分为假手术组、模型对照组、NABP 20、10、5 mg/kg和阳性对照药尼莫地平10 mg/kg组。给药20 d后，采用HE染色观察大鼠皮层及海马神经元形态学变化，流式细胞术测定两脑区的神经细胞凋亡百分率，双波长荧光光度法测定两脑区细胞内游离钙离子浓度(〔Ca2+〕i)。结果 NABP明显抑制模型大鼠皮层及海马神经细胞的变性坏死，可以降低两脑区神经细胞凋亡百分率及降低两脑区(〔Ca2+〕i)。结论 NABP具有神经保护作用，该作用可能与其降低神经细胞内钙，抑制钙超载有关。

N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮;血管性痴呆;凋亡;钙

患者常伴有不同程度的智力障碍，严重者不仅影响患者的生存质量，而且增加社会和家庭负担。但目前临床上尚无有效的治疗办法和控制本病的特效药物〔1，2〕，因此VD治疗药物的开发成为新药研发的一个热点。N-〔(2-乙酰氧基)苯甲酰基〕-吡咯烷-2-酮(N-{(2-acetoxyl)benzoyl}-2-pyrrdidone，NABP)为新合成的吡咯烷类衍生物，本文采用双侧颈总动脉反复夹闭再灌注同时腹腔注射硝普钠降压法建立VD大鼠模型，观察NABP对模型大鼠的神经保护作用，并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，体重250～300 g，由河北省实验动物中心提供，试验期间饲养于专用饲养笼内，每盒2只，自由进食饮水。

1.2 药物、试剂与仪器 NABP由河北化工职业技术学院王刚副教授惠赠，批号:080612，纯度为99.0%;注射用硝普钠由北京双鹤现代医药技术有限公司生产;尼莫地平片由正大青春宝药业有限公司生产，批号:000605;碘化乙碇:Sigma公司;Fluo-star型多功能微分析仪:德国BM公司;FACS420流式细胞仪:美国BD公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组 按性别、体重将动物随机分为6组，即假手术组、模型对照组、NABP(20、10、5 mg/kg)组、阳性对照药尼莫地平10 mg/kg组。

1.3.2 模型制备〔3〕参照文献采用双侧颈总动脉(CAA)反复夹闭再灌注同时腹腔注射硝普钠降压法建立血管性痴呆模型。腹腔注射35 mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后，仰位固定于手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离双侧CCA，在夹闭双侧CAA之前，模型对照组、NABP处理组和尼莫地平组均腹腔注射硝普钠2.5 mg/kg，随即用无创动脉夹夹闭颈总动脉10 min，再通10 min，再夹闭10 min，然后缝合伤口，放回笼中保温饲养。假手术组的麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断CAA，不注射硝普钠。

1.3.3 给药剂量及方式 所有药物均以蒸馏水配制成混悬液灌胃给予，每天一次，灌胃容积为1 ml/100 g体重，术后10 d开始，连续给予20 d，假手术组和模型对照组每天灌胃给予相量的蒸馏水。

1.3.4 组织病理学检查 末次给药后1 h，每组取大鼠5只，断头取脑，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，冠状切片，HE染色，光学显微镜下观察大脑皮层及海马神经元形态。

1.3.5 细胞凋亡的定量分析〔4〕末次给药后每组取大鼠5只，断头取脑，剥离皮层及海马组织，冷70%乙醇中固定，用机械法分散神经细胞，经300目铜网过滤，以0.01 mol/L PBS洗涤并制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/ml，碘化乙啶染色，FACS420流式细胞仪测定，将所得数据经Bioconsort专用软件处理，分析细胞的凋亡百分率。

1.3.6 神经细胞内游离钙离子浓度(〔Ca2+〕i)的测定〔5〕末次给药后1 h，取每组剩余5只大鼠，断头取脑，剥离皮质和海马组织，分别置于冰冷D-Hank's液中冲洗，于DMEM培养液中剪碎，吸管吹打分散细胞，经300目铜网过滤，离心后弃上清，以DEME培养基制成单细胞悬液，台盼蓝排斥试验检查，细胞成活率达90%以上。细胞悬液在37℃水浴中预温5 min，加入5μmol/L的Fura-2/AM避光振荡40 min进行负载，负载后的细胞以D-Hank's液洗涤，制成1×106个/ml的单细胞悬液，采用Fluo-star型多功能微分析仪，于激发波长为340和380 nm，发射波长为505 nm，测定荧光强度，并按文献公式计算了神经细胞〔Ca2+〕i。

2 结果

2.1 NAPB对血管性痴呆大鼠脑组织形态学的影响 与假手术组相比，模型大鼠海马锥体细胞及皮层细胞大量变性，部分神经细胞胞核深染，固缩变形，给予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg进行干预，可以明显改善这种变化。

2.2 NAPB对血管性痴呆大鼠神经细胞凋亡的影响 模型对照组大鼠海马区和皮质区细胞凋亡百分率明显高于假手术组，灌胃给予NAPB 20、10 mg/kg或尼莫地平10 mg/kg，细胞凋亡百分率明显降低，但NAPB 5 mg/kg对细胞凋亡百分率无明显影响。见表1。

表1 NAPB对VD大鼠神经细胞凋亡的影响(±s，n=5)

表1 NAPB对VD大鼠神经细胞凋亡的影响(±s，n=5)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型对照组比较:2)P＜0.01

组别 剂量(mg/kg)海马脑区 皮层脑区假手术组 － 1.6±0.21) 0.5±0.11)模型对照组 － 10.2±0.4 6.9±0.6尼莫地平组 10 7.3±0.51) 4.0±0.62)NABP组 20 5.4±0.92) 3.1±0.52)10 6.9±0.72) 5.2±0.22)5 9.7±0.5 6.7±0.4

2.3 NAPB对血管性痴呆大鼠神经细胞〔Ca2+〕i的影响 模型对照组大鼠海马区和皮质区〔Ca2+〕i较假手术组大鼠两脑区有明显升高，给予NAPB 20、10mg/kg或尼莫地平10mg/kg后〔Ca2+〕i明显降低，NAPB 5mg/kg组大鼠两脑区〔Ca2+〕i与模型对照组〔Ca2+〕i相比无明显变化。见表2。

表2 NAPB对VD大鼠神经细胞〔Ca2+〕i的影响(±s，n=5)

表2 NAPB对VD大鼠神经细胞〔Ca2+〕i的影响(±s，n=5)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型对照组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05

组别 剂量(mg/kg)海马脑区 皮层脑假手术组 － 148±251) 159±371)模型对照组 － 346±48 328±44尼莫地平组 10 248±533) 238±313)NABP组 20 203±422) 199±402)10 246±403) 224±392)324±46 312±51 5

3 讨论

VD是由于缺血或出血性脑血管疾病以及全脑缺血缺氧而引起的认知功障碍，主要表现为智能衰退。血管性痴呆引起智能衰退与脑缺血造成的神经损伤密切相关。而神经细胞内钙超载则是引起细胞损伤的重要原因〔6〕。钙离子(Ca2+)是维持神经信号传递的重要第二信使，细胞内Ca2+水平极微小的变化就有可能引起一系列变化。脑缺血后细胞内Ca2+浓度异常增高，引起钙超载，激活钙依赖性磷脂酶和蛋白酶，引起线粒体结构和功能的损害，进一步增加膜对离子的通透性，诱发神经凋亡或坏死〔7〕。本实验结果显示，大鼠造模成功后，其海马锥体细胞及皮层细胞大量变性，部分神经细胞胞核深染，固缩变形，且两脑区细胞凋亡百分率明显升高，而给予NABP干预后，可以逆转这种变化，说明NABP对脑神经元具有一定的保护作用。为了进一步探讨其神经保护作用的可能机制，我们又采定了两脑区〔Ca2+〕i，结果发现 NABP可以降低两脑区〔Ca2+〕i，抑制由于脑缺血造成的钙超载。当然，大量的研究显示，缺血后机体的抗氧化能力降低也是引起神经损伤的原因，NABP在抑制钙超载的同时，是否具有其他方面作用，有待进一步研究。

1 Roman GC.Vascular dementiamay be themost common form of dementia in the elderly〔J〕.JNeurol Sci，2002;15(203-204):7-10.

2 Kalaria RN，Maestre GE，Arizaga R，etal.Alzheimer's disease and vascular dementia in developing countries:prevalence，management，and risk factors〔J〕.Lancet Neurol，2008;7(9):812-26.

3 王 蕊，杨秦习，唐一鹏，等.大鼠拟“血管性痴呆”模型的改进〔J〕.中国病理生理杂志，2000;16(10):914-6.

4 左连富.流式细胞样品制备技术〔M〕.北京:华夏出版社，1991:14-9.

5 张均田.现代药理实验方法〔M〕.北京:中国协和医科大学联合出版社，1998:473-82.

6 Xiong Z，Liu C，Wang F，et al.Protective effects of breviscapine on ischemic vascular dementia in rats〔J〕.Biol Pharm Bull，2006;29(9):1880-5.

7 Blalock EM，Chen KC.Sharrow K，etal.Genemicroarrays in hippocampal aging:statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment〔J〕.JNeurosci，2003;23(9):3807-19.

R965

A

1005-9202(2011)12-2274-02

1 河北化工医药职业技术学院制药系 2 石家庄高等医学专科学校

王 刚(1969-)，男，硕士，副教授，主要从事药物药理学研究。

李杰茹(1969-)，女，硕士，高级讲师，主要从事老年抗衰老、抗痴呆研究。

〔2010-10-26收稿 2011-01-20修回〕

(编辑 刘 愉/曹梦园)