可注射温敏壳聚糖/甘油磷酸钠基水凝胶在医学中应用进展*

孙 斌 刘洪臣

水凝胶是一种亲水性的多聚物的三维网络结构物质，它能够吸收和保留相当一部分水份并使它们维持一定的形状[1]，由于其亲水的特性，被广泛的应用于生物医药领域[2]。其最大的优点在于它们可以在液态下复合细胞、治疗性的药物、生长因子等，以内窥镜或者注射器等微创的方式将其植入体内并且在原位形成凝胶。通常，它们以化学交联或者物理交联的方式使水凝胶在原位完成液态至固态(凝胶)的相转变过程。化学交联是指通过光聚合反应(photopolymerization)[3]，二硫化物粘合(disulfide bond)，或者由硫氢基、丙烯酸酯、砜基[4]等交联剂引发化学反应而引发凝胶化。物理交联是指通过一些环境因素的改变，如pH值、温度、或者二者共同的刺激引发凝胶化。由于物理交联的水凝胶能在体外以很好的流动性接种细胞等物质，在体内接受物理刺激迅速的转变为固态凝胶，而且避免了光的辐照，化学交联剂的污染，以及在化学交联可能引发的体积变化和产热等缺点，所以近些年来，此类依靠温度、pH刺激引发凝胶化的水凝胶系统尤为得到人们的广泛关注[5]。

2000年，chenite等[6]利用酸性的壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠(GP)制备了一种具有中性pH值，依靠温度改变引发凝胶化的壳聚糖/GP基水凝胶系统。壳聚糖是一种可生物降解，具有天然抗菌性以及良好生物形容性的天然多聚体[7,8]。由于壳聚糖良好的生物性能，这种壳聚糖/GP基水凝胶系统成为人们研究的热点。下面，我们就它的一些凝胶机制，以及在药物缓释及组织工程研究应用等方面作一个综述。

1.壳聚糖/GP基水凝胶的凝胶特性

壳聚糖是一种天然的阳离子多糖,当pH小于6.2时溶解于醋酸等酸性溶液中，当高于这个数值则出现白色絮状沉淀。Chenite首次在2000年，用高脱乙酰度的壳聚糖和甘油磷酸钠混合，得到了pH值中性且在常温下可长时间保持液态的壳聚糖/甘油磷酸钠(GP)复合物。这种混合物具有温敏活性,即在室温或低于室温时可保持液态较长时间,而温度升高到生理体温(37℃)后发生凝胶化。其研究小组进一步研究发现[9]，壳聚糖的脱乙酰度对于此壳聚糖/GP凝胶体系的影响较大。当壳聚糖的脱乙酰度越低时，凝胶所需要的温度越高，而且相应凝胶化的时间也越长一些。壳聚糖的分子量则对于凝胶温度的影响不是很大。而当壳聚糖的脱乙酰度以及浓度保持不变时，GP的浓度直接影响着凝胶的温度，当GP升高时，pH上升，凝胶温度下降。与此同时，裸鼠体内的炎性反应实验也表明，壳聚糖/GP中壳聚糖的脱乙酰度越高其生物相容性越好[10]。

对于这种水凝胶的凝胶原理，人们到现在仍然没有得出确切的结论，但是研究者对此还是形成了一些初步的认识。起初，研究者认为是由于加入了GP之后，由于温度的上升，GP与壳聚糖之间的分子力上升而使得溶液中疏水作用的增强从而引起凝胶化[6,9，11]。但是随后的研究认为，由于温度升高，两者之间的离子间的分子作用力反而是降低的，是由于壳聚糖中的阳离子胺基基团与GP中的磷酸盐阴离子发生质子的转换，才使得凝胶化形成[12]。之后的实验也证实，使用双蒸水清洗的壳聚糖/GP基水凝胶中的N和P物质是可以移除的，从而证明GP并没有通过离子力或者共价力与壳聚糖相交联[13]。所以，壳聚糖/GP基的水凝胶属于物理交联的水凝胶，相比其他一些用化学交联剂制备的壳聚糖及其衍生物水凝胶，其制备方法显得更加绿色环保。

2.壳聚糖/GP基水凝胶作为缓释系统的应用

由于壳聚糖/GP基水凝胶的pH值接近中性，而且是通过物理交联的水凝胶，在交联的过程中避免了使用化学交联剂，所以它非常适合作为一些敏感大分子如蛋白质及肽类药物的载体。Ruel-Garie′py等人[14]首次将壳聚糖/GP应用到药物缓释的研究。随后，他们又尝试壳聚糖/GP对亲水性小分子类脂质体的缓释，也取得了良好的效果[15]。2004年，研究小组又将另一种疏水性的抗肿瘤药物紫杉醇与壳聚糖/GP水凝胶复合[16]，发现紫杉醇在壳聚糖/GP中体外缓释的时间超过了一个月。在体内实验中他们将复合药物的凝胶直接注射到鼠的乳腺肿瘤中，对肿瘤的抑制作用明显，且相比较传统的药物使用方法，这种局部用药具有全身毒性作用小的优点。最近，Sung wooKim等人[17]利用壳聚糖/GP复合另一种用于肿瘤化学治疗的鞣花酸(ellagic acid)，发现其对两种脑部肿瘤细胞的生长有着明显的抑制作用。

Wu等[18]研究发现，当缓释药物时，壳聚糖/GP水凝胶在酸性或碱性条件下均发生较强的突释，而在用季铵盐壳聚糖与GP构建的水凝胶中，药物缓释显得较为缓慢。随后，其研究小组还利用聚乙稀醇(PEG)与壳聚糖交联，制备了壳聚糖-PEG/GP水凝胶体系用作鼻类药物载体，发现其无毒性，而且有利于亲水性大分子药物鼻内的黏附释放[19]。吉秋霞等也利用改性的季铵盐壳聚糖与GP制备水凝胶缓释洗必泰，发现其对某些牙周致病菌有着良好的抑制作用[20]。此外，第四军医大学马志伟等人[21]尝试利用壳聚糖/GP温敏水凝胶双缓释骨形成蛋白和氯己定用于牙周组织再生的初步实验研究，也取得了一定的效果。由此可见，壳聚糖/GP基水凝胶能适用于多种用途的缓释。

3.壳聚糖/GP基水凝胶在组织工程及再生医学中的应用

3.1 软骨组织工程的应用

由于局部血供不足，膝关节软骨的自我再生能力很差，细胞治疗就被认为是很希望的软骨再生的修复方式，但在软骨细胞的培养中发现，在经过三四代培养后，软骨细胞往往失去分泌软骨基质的能力。而壳聚糖在结构上与软骨基质中的糖胺聚糖(GAG)以及透明质酸很相似，所以Hoemann等人[22]利用壳聚糖/GP水凝胶模拟软骨的细胞外基质复合软骨细胞进行培养，发现软骨细胞在支架中生长良好，仍然发挥其软骨细胞表型。随后，其研究小组将壳聚糖/GP与自体血相复合，进行一系列的体内体外实验，成骨的在软骨缺损的动物模型上取得了成功的软骨再生[23-25]。国内的研究者将羟乙基纤维素(HEC)加入壳聚糖/GP中提高了其力学性能，也在山羊的膝软骨缺损模型中取得了修复成功[26]。除此之外，壳聚糖/GP优越的可注射性能使得软骨缺损的微创治疗变得十分的可行，具有十分良好的临床应用前景。

3.2 骨组织工程的应用

壳聚糖很早就被作为支架材料单独或者联合的应用到骨组织工程中，被证明其具备良好的骨传导性能，以及一定的促进成骨细胞增殖的作用[27]。Kyung Sook Kim等人[28]尝试将鼠肌肉来源的间充质干细胞与壳聚糖/GP复合，同时在壳聚糖/GP中预先混合了一定比例的成骨诱导液，将其植入裸鼠皮下，四周后的组织切片的von kossa染色阳性，而且同时还发现支架中复合的间充质干细胞对侵润的宿主炎性细胞有免疫抑制作用。其研究小组还发现，骨组织工程中使用最广泛，研究最多的骨髓来源的间充质干细胞也在壳聚糖/GP水凝胶中生长良好[29]。他们认为壳聚糖/GP有着良好的骨组织工程支架材料应用潜力。

3.3 心肌组织工程

心肌梗塞造成心肌细胞缺失，对局部缺血以及坏死部位的细胞治疗面临着移植细胞的存留率以及存活率不高的困境，国内军事医学科学院卢文宁等人[30，31]尝试将胚胎干细胞加入到壳聚糖/GP水凝胶中，植入到局部心肌梗塞的鼠模型中，四周后，梗塞区域的心脏功能，心室壁厚度，以及血管密度均显著高于对照组。他们认为壳聚糖/GP水凝胶是一种非常适宜的心肌细胞载体能被应用于心肌组织工程。

3.4 其他

和软骨组织一样，髓核也是一种无血管的组织，其自身的再生能力很差，Roughley等人[32-34]将壳聚糖/GP与髓核细胞相复合，一系列的体内体外研究显示，壳聚糖/GP水凝胶也取得了良好的髓核再生修复的效果。此外壳聚糖/GP还被应用到神经及脑再生修复等领域中[35，36]。

4.小结与展望

综上所述，壳聚糖/GP基水凝胶是一种良好的细胞与药物的载体，可以被用于药物缓释以及组织工程等众多领域。但是，虽然壳聚糖/GP水凝胶在生物医药领域的多个方向已经有所建树，但它也存在着一些自身的缺点，如力学性能较差。此外，单一使用一种材料构建的支架材料作用比较有限，今后，我们可以尝试将壳聚糖进行改性，如之前提到的季铵盐壳聚糖，或者与一些合成的高分子多聚物如聚乙烯醇(PEG)、聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)等进行接枝，又或者与其他的一些天然或者合成的生物性能好的材料比如胶原，PLGA，TCP等与壳聚糖进行有效的物理交联，力图发挥各自材料的优点，弥补对方的缺点，构建一种能发挥多种功效的智能的复合型水凝胶支架材料。

[1]A.S.Hoffman,Hydrogels for biomedical applications[J].Adv Drug Delivery Rev，2002，54：3

[2]Jeanie L.Drury,David J.Mooney，Hydrogels for tissue engineering：scaffold design variables and applications[J].Biomaterials,2003，24：4337-4351

[3]C.R.Nuttelman,S.M.Henry,K.S.Anseth,Synthesis and characterization of photocrosslinkable,degradable poly(vinylalcohol)-based tissue engineering scaffolds[J].Biomaterials，2002，23：3617

[4]A.Goessl,N.Tirelli,J.A.Hubbell,A hydrogel system for stimulus-responsive,oxygen-sensitive in situ gelation[J].J.Biomater.Sci.Polym.Ed,2004，15：895

[5]Bae JW,Go DH,Park KD.Thermosensitive chitosan as an injectable carrier for local drug delivery[J].Macromolecular Res，2006，14(4)：461-465

[6]Chenite A,Chaput C,Wang D,Combes C,Buschmann MD,Hoemann CD,Leroux JC,Atkinson BL,Binette F,Selmani A.Novel injectable neutral solutions of chitosan form biodegradable gels in situ[J].Biomaterials，2000，21：2155-2161

[7]Kim IY,Seo SJ,Moon HS,Yoo MK,Park IY,Kim BC,et al.Chitosan and its derivatives fortissue engineering applications.Biotechnol Adv，2008，26：1-21

[8]贾洪诚,王 璇,李晓光,柳月红.壳聚糖和氯己定协同抗菌斑作用的实验研究[J].中华老年口腔医学杂志，2010，01：011

[9]Chenite A,Buschmann M,Wang D,Chaput C,Kandani N.Rheological characterization of thermogelling chitosan/glycerol-phosphate solutions[J].Carbohydr Polym，2001，46：39-47

[10]Molinaro G,Leroux JC,DamasJ,Adam A.Biocompatibility of thermo-sensitive chitosan-based hydrogels：an in vivo experimental approach to injectable biomaterials[J].Biomaterials，2002，23：2717-2722

[11]Cho J,Heuzey MC,Begin A,Carreau PJ.Physical gelation of chitosan in the presence of beta-glycerophosphate：the effect of temperature[J].Biomacromolecules， 2005， 6：3267-3275

[12]LavertuM,FilionD,BuschmannMD.Heat-induced transfer of protons from chitosan to glycerol phosphate produces chitosan precipitation and gelation[J].Biomacromolecules，2008，9：640-650

[13]Iliescu M,Hoemann CD,Shive MS,Chenite A,Buschmann MD.Ultrastructure of hybrid chitosan–glycerol phosphate blood clots by environmental scanning electron microscopy[J].Microsc Res Tech，2008，71：236-247

[14]Ruel-Garie′py,A.Chenite,C.Chaput,S.Guirguis,J.-C.Leroux,Characterization of thermosensitive chitosan gels for the sustained delivery of drugs[J].Int.J.Pharm，2000，20：389-398

[15]Ruel-Garie′py,et al.Thermosensitive chitosan-based hydrogel containing liposomes for the delivery of hydrophilic molecules[J].J Control Release，2002，2182(2-3)：373-383

[16]Ruel-Garie′py,Shive M,Bichara A,Berrada M,Garrec DL,Chenite A,et al.A thermo-sensitive chitosan-based hydrogel for the local delivery of paclitaxel[J].Eur J Pharm Biopharm，2004，57：53-63

[17]Sungwoo Kim etal.A chitosan/b-glycerophosphate thermo-sensitive gel for the delivery of ellagic acid for the treatment of brain cancer[J].Biomaterials， 2010， 31：4157-4166

[18]Wu J,Su ZG,Ma GH.A thermo-and pH-sensitive hydrogel composed of quaternized chitosan/glycerophosphate[J].Int J Pharm，2006，315：1-11

[19]Wu J,Wei W,Wang LY,Su ZG,Ma GH.A thermosensitive hydrogel based on quaternized chitosan and poly(ethylene glycol)for nasal drug delivery system[J].Biomaterials,2007，28：2220-2232

[20]Qiu Xia Jiet al.A novelinjectable chlorhexidine thermosensitive hydro gel forper iodontal application：preparation,antibacterial activity and toxicity evaluation[J].J Mater Sci： Mater Med，2010，21：2435-2442

[21]马志伟，张勇杰，吴织芬,等.骨形成蛋白和氯己定双缓释的壳聚糖温敏凝胶用于牙周组织再生的实验研究[J].华西口腔医学杂志，2008，45(5)：273-277

[22]Hoemann CD,Sun J,Le′gare′A,McKee MD,Buschmann MD.Tissue engineering of cartilage using an injectable and adhesivechitosanbasedcell-delivery vehicle[J].Osteoarthritis Cartilage，2005，13： 318-329

[23]Hoemann CD,Hurtig M,Rossomacha E,Sun J,Chevrier A,Shive MS,et al.Chitosan-glycerol phosphate/blood implants improve hyaline cartilage repair in ovine microfracture defects[J].J Bone Joint Surg Am，2005，87：2671-2686

[24]Hoemann CD,Chenite A,Sun J,Hurtig M,Serreqi A,Buschmann MD,et al.Cytocompatible gel formation of chitosan-glycerol phosphate solutions supplemented with hydroxyl ethyl cellulose is due to the presence of glyoxal[J].J Biomed Mater Res A，2007，56(2)：521-529

[25]ChevrierA,HoemannCD,SunJ,BuschmannMD.Chitosan-glycerol phosphate/blood implants increase cell recruitment,transient vascularization and subchondral bone remodeling in drilled cartilage defects[J].Osteoarthritis Cartilage，2007，15：316-327

[26]T.Hao et al.The support of matrix accumulation and the promotion of sheep articular cartilage defects repair in vivo by chitosan hydrogels[J].Osteoarthritis and Cartilage，2010，18：257-265

[27]Khor,E.and Lim,L.Y.Implantable Applications of Chitin and Chitosan[J].Biomaterials，2003，24(13)：2339-2349

[28]Kim KS,Lee JH,Ahn HH,Lee JY,Khang G,Lee B,et al.The osteogenic differentiation of rat muscle-derived stem cells in vivo within in situ-forming chitosan scaffolds[J].Biomaterials,2008，29：4420-4428

[29]Cho MH,Kim KS,Ahn HH,Kim MS,Kim SH,Khang G,Lee B,Lee HB.Chitosan gel as an in situ-forming scaffold for rat bone marrow mesenchymal stem cells in vivo[J].Tissue Eng Part A，2008，14(6)：1099-1108

[30]Shuanghong Lü,Haibin Wang,Wenning Lu et al.Both the Transplantation ofSomaticCellNuclearTransfer-and Fertilization-Derived Mouse Embryonic Stem Cells with Temperature-Responsive Chitosan Hydrogel Improve Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts Both the Transplantation ofSomatic CellNuclear Transferand Fertilization-Derived Mouse Embryonic Stem Cells with Temperature-Responsive Chitosan Hydrogel Improve Myocardial Performance in Infarcted Rat Hearts[J].Tissue Engineering Part A，2010，16：4，1303-1315

[31]Lu WN et al.Functional improvement of infracted heart by co-injection of embryonic stem cells with temperatureresponse chitosan hydrogel[J].Tissue Engineering Part A，2009，15：1437

[32]Roughley P,Hoemann C,DesRosiers E,Mwale F,Antoniou J,Alini M.The potential of chitosan-based gels containing intervertebral disc cells for nucleus pulposus supplementation[J].Biomaterials，2006，27：388-396

[33]Crompton KE,Goud JD,Bellamkond RV,Gengenbach TR,Finkelstein DI,Forsythe JS,et al.Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering[J].Biomaterials，2007，28：441-449

[34]Richardson,S.M.,Hughes,N.,Hunt,J.A.,Freemont,A.J.and Hoyland,J.A.Human Mesenchymal Stem Cell Differentiation to NP-likeCellsin Chitosan-glycerophosphate Hydrogels[J].Biomaterials，2008，29(1)：85-93

[35]Crompton, K.E., Tomas, D.and Finkelstein, D.I.Inflammatory Response on Injection of Chitosan/GP to the Brain[J].J.Mater.Sci.： Mater.Med.2006，17(7)： 633-639

[36]K.E.Crompton et al.Polylysine-functionalised thermoresponsive chitosan hydrogel for neural tissue engineering[J].Biomaterials，2007，28：441-449