急性白血病细胞周期调节因子的表达及意义

梁翠微,龚五星,曲亚丽,黄翠珍,陈 晖

(暨南大学附属第三医院/珠海市人民医院血液肿瘤科,广东珠海 519000）

急性白血病是血液系统常见的恶性肿瘤之一,病程短,病死率高,化疗是其主要治疗手段。肿瘤被认为是一种细胞周期疾病,细胞增殖失控是肿瘤的基本特征,许多癌基因或抑癌基因编码的蛋白直接或间接参与细胞周期的调控。基因突变或蛋白表达异常可导致细胞周期调控紊乱,使细胞无限增殖从而发生癌变。既往研究表明白血病的发生与细胞周期调控异常密切相关[1]。本研究采用免疫组织化学法检测急性白血病细胞中细胞周期调控因子细胞S期激酶相关蛋白(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)、P27、周期蛋白(cyclin)E 和Cyclin A 1的表达,以探讨其表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2004年 1月至 2006年2月在本院住院的急性白血病患者60例。其中急性非淋巴细胞白血病(acute nonlymphocy tic leukem ia,ANLL)初发 24例、复发4例;急性淋巴细胞性白血病(acutelym phoblastic leukemia,ALL)初发17例、复发5例以及白血病完全缓解10例。41例初发患者中有35例接受化疗,6例未接受化疗,失访。另外,将 10例非恶性血液病患者(其中缺铁性贫血3例,特发性血小板减少性紫癜3例,珠蛋白生成障碍性贫血2例,遗传性球形细胞增多症1例,巨幼细胞贫血1例)作为对照进行前瞻性研究。将研究对象分为4组:初发组41例,复发组9例,完全缓解组10例及对照组10例。所有病例均经骨髓检查确诊,诊断分型标准参考1986年天津白血病分类、分型讨论会提出的标准。

1.2 诱导缓解方案 初诊 ANLL患者(除 ANLL-M 3外)首选DA方案(柔红霉素+阿糖胞苷),ANLL-M 3患者首选全反式维甲酸(all-trans-retinoicacid,ATRA)或亚砷酸诱导缓解;ALL患者首选VDP方案(长春新碱+柔红霉素+泌尼松)或VDLP方案(长春新碱+柔红霉素+左旋门冬酰胺酶+泼尼松)。对于复发或耐药病例选择二线药物。经标准方案化疗后,按照张之南和沈悌[2]主编的第3版《血液病诊断及疗效标准》,判断疗效,疗效分完全缓解、部分缓解及未缓解。观察患者临床症状及其对化疗的反应,收集外周血白细胞计数、乳酸脱氢酶等临床资料。

1.3 主要试剂与免疫细胞化学检测 主要试剂包括鼠抗人Skp2单克隆抗体、鼠抗人P27单克隆抗体、鼠抗人Cyclin E单克隆抗体、鼠抗人Cyclin A 1单克隆抗体、Super Pic-Ture聚合物检测试剂盒及苏木素复染剂(购自美国抗体诊断公司)。免疫细胞化学检测:取不同病期患者新鲜骨髓直接进行骨髓涂片,封片后-70℃冰箱保存备检。骨髓涂片采用美国抗体诊断公司(Antibody Diagnostica inc.)推出的新一代“二步法”系统检测,即通过葡聚糖骨架将多个辣根过氧化酶与抗-抗体聚合进行标记的免疫细胞化学检测。

1.4 结果观察 在光镜下观察和采集图象。将细胞核呈棕黄色者记为阳性细胞,在高倍显微镜下每片计数400个单个核细胞,计算阳性细胞的百分率。阳性细胞百分率:＜20%为阴性,≥20%为阳性[3]。

1.5 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验及 Fisher's精确检验;采用多因素Logistic回归法分析年龄、性别、外周血白细胞计数、乳酸脱氢酶水平和Skp2、Cyclin E、Cyclin A 1及P27与患者完全缓解率的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 急性白血病不同组别细胞周期调控因子 Skp2、P27、Cyclin E和Cyclin A1的表达 急性白血病初发组及复发组Skp2、Cyclin E和Cyclin A 1表达明显高于完全缓解组及对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),急性白血病复发组Cyclin E表达明显高于初发组表达,差异有统计学意义(P＜0.05),Skp2和Cyclin A 1在初发组和复发组表达差异无统计学意义(P＞0.05)。P27在初发组、完全缓解组及对照组的表达差异无统计学意义(P＞0.05),在复发组的表达较其他3组低(P＜0.05)。不同类型急性白血病细胞周期调控因子的表达见表1。

表 1 各组骨髓细胞Skp2、P27、Cyclin E和Cyclin A1的表达阳性率(%)

2.2 细胞周期调控因子Skp2、P27、Cyclin E和 Cyclin A 1阳性表达与患者临床特征的关系 急性白血病患者骨髓细胞Skp2、P27、Cyclin E和Cyclin A 1阳性表达与患者年龄、性别、外周血乳酸脱氢酶水平无相关性(P＞0.05);Skp2与外周血白细胞计数呈正相关(P＜0.05),而 P27、Cyclin E和 Cyclin A1与其无明显相关性(P＞0.05);Skp2与完全缓解率呈负相关(P＜0.05),P27与其呈正相关(P＜0.05),Cyclin E和Cyclin A1与其无明显相关性(P＞0.05)。见表 2。

表2 急性白血病初发组患者Skp2、P27、Cyclin E和Cyclin A1阳性表达与临床特征的相关性

2.3 多因素逻辑回归分析 以Skp2、P27、Cyclin E、Cyclin A1及年龄、性别、外周血白细胞计数、外周血乳酸脱氢酶水平作自变量,以是否临床完全缓解为应变量,用向前筛选法进行多变量Logistic回归分析,在上述多个可能影响完全缓解率的因素下,Skp2和P27是影响完全缓解率的独立预后因素,Skp2和P27的比值比(odd ratio,OR)分别是 0.076和 6.842,Skp2表达越高,完全缓解率越低,而 P27表达越高,完全缓解率也越高。

3 讨 论

真核生物细胞周期调控网络主要由Cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor,CKI)构成,各因子相互作用,从而对细胞周期发挥调控作用[4]。CDK是细胞周期调控的中心环节,受Cyclin和CKI双重调节,CDK与Cyclin结合而被活化,促进细胞增殖;与CKI结合则失活,阻止细胞周期的进行。白血病是血液系统常见的恶性肿瘤之一,白血病的发生是因正常骨髓造血细胞染色体多重损伤引起的复杂过程,其最终表现为细胞周期调控机制的紊乱,造血细胞增殖、分化异常,细胞周期调控异常是白血病发生过程中的重要机制之一。

本研究表明初发及复发的急性白血病患者骨髓细胞Cyclin A 1的表达水平明显高于完全缓解组及对照组,表明Cyclin A1与白血病的发生有一定关系,Cyclin A 1的过表达使细胞跨跃细胞周期调控点,从而影响细胞周期进程,促进恶性细胞克隆增殖。有研究发现在急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞中Cyclin A 1高表达的机制主要为相关融合蛋白早幼粒细胞白血病-维甲酸受体(p romyelocy tic leukem ia-retinoic acid recep tor,PM L-RAR)和早幼粒细胞白血病锌指蛋白(p romyelocy tic leukem ia Zinc-finger,PLZF-RAR)能活化 Cychn A1的启动区,从而引起Cychn A 1在急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞中的高表达[5]。

目前人们认为Cyclin A 1表达水平的高低代表S期细胞增殖活性的高低。S期细胞所占比例高,患者化疗易缓解。Ekberg等[6]对40例急性骨髄性白血病(acute myeloid leukem ia,AML)患者 Cyclin A 1、Cyclin A 2、Cyclin B1、Cyclin E、CDK 1、CDK2、P21和 P27蛋白进行检测,表明只有Cyclin A1蛋白水平与患者的预后有关,Cyclin A1高表达的患者较低表达患者的无病生存期及总的生存期短。但研究表明,虽然Cyclin A1在急性白血病中表达水平增高,但未发现其表达水平与缓解率相关[7]。

本研究初发及复发的急性白血病患者中Cyclin E表达水平明显高于完全缓解组及对照组,且复发组Cyclin E表达水平明显高于初发组表达水平,表明Cyclin E可能与复发有关,有可能作为临床估计预后的参照指标,且对Cyclin E高表达的急性白血病患者缓解后的转归观察提示,急性白血病Cyclin E表达对复发更具早期诊断意义。Cyclin E/CDK 2是G1期的重要激酶复合物,该激酶复合物是细胞通过G1/S调控点的关键,Cyclin E过表达促使细胞通过G1期进入S期,从而过度增殖形成肿瘤[8]。P27可特异性抑制该激酶复合物活性而发挥细胞周期负调节作用。在一些实体瘤中存在P27的低表达与Cyclin E的高表达,二者呈负相关[9-10]。本研究表明Cyclin E和P27蛋白在白血病细胞中的表达呈正相关,说明在人类白血病细胞中可能通过一定异常机制调节二者表达水平。

Skp2作为泛素蛋白酶体途径的底物识别序列,能够泛素化降解P27。在许多实体瘤中发现Skp2的高表达与P27的低表达相关[11],而且最近在慢性粒细胞白血病中也有相关研究[12]。Skp2在急性白血病中研究较少,本研究并未发现Skp2和P27的表达呈负相关,因此表明,尽管Skp2的高表达与细胞的增殖程度和疾病进展有关,但可能还存在其它分子参与Skp2在肿瘤发生中的作用或P27的调节异常。最近也有研究认为Skp2的功能并不只限于对P27的降解[13-14]。本研究表明P27的表达水平与化疗疗效有关,二者差异有统计学意义,P27蛋白水平高,完全缓解率高。Radosevic等[15]的研究结果显示P27蛋白水平与患者对化疗的敏感性相关,P27水平越高,患者对化疗越敏感,白血病细胞P27蛋白的高表达,可作为患者能够完全缓解的预测指标。

急性白血病是以化疗为首选的治疗手段,目前较明确的影响化疗缓解的因素包括年龄、初诊时外周血白细胞总数、白血病的类型。由于病例数较少,本研究以已知的影响预后因素Skp2、P27、Cyclin E、Cyclin A 1 及年龄、性别、外周血白细胞计数、外周血乳酸脱氢酶水平作自变量,以是否完全缓解为应变量,用逐步筛选法进行多变量Logistic回归分析,在上述多个可能影响缓解率的因素下,Skp2和P27是影响完全缓解率的独立预后因素,Skp2表达高,完全缓解率低,而P27表达高,则完全缓解率较高。通过联合检测急性白血病患者骨髓细胞中Skp2及P27表达水平对预测其化疗疗效具有一定的临床价值。

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