EphA4-ephrinA3系统在海马脑区缺血/再灌注中的表达变化1)

2011-02-21 11:57刘乃红李建国
中西医结合心脑血管病杂志 2011年9期
关键词:迟发性星形谷氨酸

刘乃红,王 锐,王 晔,李建国,张 策

建立短暂前脑缺血/再灌注模型,观察海马(EphA4-ephrinA3)的分布特点及在缺血/再灌注过程中的动态变化规律,同时进行神经元凋亡的相关检测,以期明确EphA4在神经元迟发性死亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠,体重180g~240g,随机分为两组。伪手术对照组,缺血/再灌注组(缺血15min,再灌注6 h、24h、48h),每组6只。

1.2 大鼠前脑缺血/再灌注模型的建立 采用改良的Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。行升主动脉灌注固定以进行TUNEL染色,麻醉后断头提取新鲜大脑海马组织,并分离海马组织的上半部,主要为CA1区,以及下半部,主要为CA3区,保存于-80℃,以进行Caspase 3活性的测定。伪手术(sham)组先行灼闭双侧椎动脉,次日打开颈部切口但不夹闭颈动脉造成缺血,余处理同缺血/再灌注组。

1.3 海马组织神经元TUNEL染色 利用In Situ Cell Death Detection试剂盒(Promega公司)进行检测。应用BI2000医学图像分析系统进行拍照分析。计数海马锥体神经元中阳性细胞所占的百分比。

1.4 海马组织Caspase 3活性分析 提取海马组织样品,冰浴中匀浆,离心取上清。按试剂盒说明测定蛋白浓度及Caspase-3活性。结果以比活性反应海马组织中Caspase-3的活性。

1.5 Western blot测定EphA4和ephrinA3的蛋白表达 利用SDS-PAGE电泳技术分离匀浆组织中的蛋白,再转移至硝酸纤维素膜。用 EphA4,ephrinA3单克隆抗体(Santa Cruze,Inc),免疫印迹检测脑组织EphA4,ephrin A3含量。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0软件分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 短暂脑缺血/再灌注对海马CA1区神经元迟发性死亡的影响 至缺血/再灌注后7d,CA1区细胞带消失,提示CA1区神经元大量死亡。脑缺血/再灌注7d组,显示CA1区广泛锥体神经元死亡,而CA3和齿状回细胞无明显变化。

2.2 海马CA1区Caspase 3活性增高及神经元凋亡增加Caspase 3活性在缺血/再灌注后6h即有升高,6h、24h、48h OD值分别为2.30±0.19,2.20±0.28,1.900±0.015,与sham组(OD值为1.100±0.017)比较有统计学意义(P<0.05)。TUNEL检测结果与Caspase一致(TUNEL阳性率分别为24.50±5.36,22.30±4.76,23.80±4.17)。短暂脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元凋亡增加,与sham组(5.33±3.33)比较有统计学意义(P<0.05)。

2.3 CA1区ephrinA3与EphA4蛋白表达 与对照组相比,海马缺血/再灌注后6h海马CA1区组织中ephrin A3的含量显著增高,IOD值为2.05±0.12vs 0.78±0.02(P<0.05),随后明显减少,但在再灌注24h与对照相比仍有统计学意义,再灌注48h逐渐回复至对照组水平。EphA4也有缺血诱导的增高,再灌后6h与对照组相比即有明显增高(2.21±0.12vs 0.72±0.03,P<0.05),之后逐渐下降,再灌注后24h与对照相比仍有明显差异,至48h与对照组相比无明显差异。

3 讨 论

海马脑区在学习记忆中具有重要作用,但其对缺血损伤极为敏感,尤以CA1区为著。在缺血/再灌注过程中,海马神经元受到多种因素的损伤刺激后,如兴奋性神经毒素、氧化应激、炎症,而发生死亡。在缺血后极短的时间内,由于能量供应急剧减少,依赖ATP的各种功能障碍很快出现,首先表现为离子梯度的改变,膜的去极化,以及细胞外谷氨酸及其他神经递质的升高[1],继之以胞内钙的升高,启动了细胞死亡过程[2,3]。如果缺血过程较为短暂,则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡[4]。

海马区酪氨酸激酶受体-配体(Eph-ephrin)在星形胶质细胞与神经元的相互作用中扮演了重要的角色。Eph及ephrin均为膜蛋白,通过Eph向细胞内传递的信号称为正向信号,通过其配体ephrin的信号称为反向信号。它们参与正常组织中血管生成、组织边界形成、细胞迁移、轴突导向和塑型以及骨稳态调节等[5,6]。

ephrinA3是成年海马区最为丰富的ephrin-A配体。ephrinA3标记主要位于GFAP阳性星形胶质细胞上。在脑中,星形胶质细胞ephrinA3与神经元EphA4之间的相互作用可调节突触后神经元形态[7,8]

本研究发现,在缺血/再灌注后,海马CA1区神经元发生迟发性死亡,TUNEL染色可见有大量凋亡神经元,而Caspase 3的活性在CA1也有显著增高。在CA1区锥体神经元,再灌注后caspase 3的过表达与锥体神经元DNA断裂及迟发性死亡是密切相关的。在单纯缺血/再灌注组caspase 3活性升高。同时在再灌注后6h,海马CA1区ephrinA3即有显著升高,之后逐渐下降,这种缺血诱导的ephrinA3表达增高与Pulkkinen等在局灶性脑缺血中观察到的结果一致,即缺血可以诱导海马区ephrinA3的表达。对照侧海马CA3区也有表达,但较缺血侧明显较低,且表达方式也不同[9]。EphA4在反应性星形胶质细胞也有表达[10,11]。本研究观察到EphA4在缺血/再灌注后的海马CA1区也有升高,这表明ephrinA3/EphA4可能参与了缺血后的病理过程,推测与以下一些因素有关。首先,ephrinA3与EphA4的上调通过对突触间隙谷氨酸浓度调节,影响了缺血/再灌注后的兴奋毒效应。前脑缺血可引起大鼠或沙土鼠海马谷氨酸转运体(glutamate transporter 1,GLT-1)表达减少,以及功能减弱,但不影响 GLAST(glutamate-aspartate transporters)的表达,这一现象先于神经元迟发性死亡发生。而GLT-1主要由星形胶质细胞表达[12-15]。有研究发现星形胶质细胞上过表达ephrinA3可降低胶质细胞上谷氨酸转运体数量,由此可调节突触谷氨酸浓度及突触后去极化,调节LTP[16]。EphA4与ephrinA3相互作用,可以下调谷氨酸转运体及减少谷氨酸摄取,ephrinA3的反向信号也可以抑制谷氨酸转运体。研究者以EphA2Fc(只与ephrin-A结合。EphA4还可与ephrin-B2结合)来结合ephrinA3,在野生型大鼠引起显著的谷氨酸摄取下降,同时引起 GLT-1与 GLAST水平下降[17]。

在脑缺血/再灌注过程中,兴奋毒是神经元重要的损伤机制,EphA4与ephrinA3的表达上调,并且,有研究表明二者的结合可抑制谷氨酸摄取。星形胶质细胞是突触间隙谷氨酸浓度的重要调控者,缺血/再灌注中其ephrinA3表达的上调可造成谷氨酸转运体的数量及功能的下降,其对于兴奋毒的加剧可能起了推波助澜的作用。

本研究发现,短暂脑缺血/再灌注可诱导海马CA1区ephrinA3与EphA4的表达明显增高,其时间过程与Caspase增高的时间过程一致,这可能是CA1细胞对脑缺血易损的一个重要机制。

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