解脲脲原体生物膜药敏检测方法的研究进展

林飞燕，陆春*，叶庭路

(1.中山大学第三附属医院皮肤病与性病科，广东广州510630;2.北京大学深圳医院皮肤病与性病科，广东深圳518036)

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，Uu)为泌尿生殖道常见微生物，与许多泌尿生殖道疾病如非淋球菌尿道炎相关，也是男性不育、女性不孕及不良妊娠的常见病因之一。近年来随着支原体耐药情况、慢性持续性难治性感染的现象愈演愈烈，支原体感染的临床治疗效果面临挑战，关于Uu耐药机制的探讨已成为Uu研究的一大热点。生物膜(Biofilm，BF)是微生物繁殖过程中将菌体包裹在自身产生的多糖、蛋白质和DNA等胞外基质中形成的团块结构，多项研究表明生物膜的形成可以增强微生物对环境和抗生素的耐受性，目前生物膜的形成已被列入细菌耐药尤其多重耐药的机制之一［1］。国外已有研究证实Uu可以形成生物被膜，并且生物膜形成可同时增强Uu对大环内酯类、喹诺酮类、四环素等多种常用抗菌素的抵抗力［2］。对Uu生物膜的形成、耐药性和耐药机制的研究，为Uu临床感染和抗生素耐药机制提供了新的探索方向。既往Uu 的体外药敏主要是针对游离菌株进行，并不能真实反映Uu体内生物膜形成和耐药情况，因此，Uu生物膜的培养及药敏检测技术将继游离支原体药敏试验之后，成为探讨Uu耐药水平与耐药机制的又一重要手段。然而由于支原体生长的生物学特性，使培养基pH发生改变，而偏碱性环境下Uu会迅速死亡的生物学特性，使实验中需要多次更换培养基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培养过程中的杂菌污染由此成为决定Uu生物膜实验成功与否的一大问题。本文将对解脲脲原体生物膜的培养与药敏检测技术进行介绍，列举可疑污染的表现及分析思路，并对实验操作过程中常见的污染途径与相应的质控策略进行探讨，希望能对今后国内生物膜相关的实验研究起到借鉴作用。

1 Uu生物膜的培养与药敏的方法

最小生物膜抑制浓度(Minimal Biofilm Inhibitory Concentration，MBIC)定义为阳性对照的微生物固定菌落刚开始使培养基变色时，某抗菌药物能抑制其实验菌培养基变色的最低浓度［2］。参考近几年国内外文献［2-3］，目前Uu生物被膜培养以及药敏试验均以尿素肉汤液体培养基为实验载体，一般在CO2温箱37℃培养48 h后进行药敏检测，具体方法如下:在96孔细胞培养板中加入Uu液体培养基180 μL/孔，再加入Uu菌液(CCU为104～105/mL)20 μL/孔，每24 h换液1次，48 h后弃去培养基，用灭菌PBS缓冲液200 μL/孔冲洗3次，弃去PBS缓冲液，再逐孔加入含不同浓度梯度的抗生素培养基200 μL/孔，滴加石蜡油1～2滴/孔，观察48 h直至阳性不加药对照孔培养基变红色时记录生物被膜的最低抑菌浓度即MBIC。

实验过程中发现，在保证培养基pH为6.0、菌液浓度单位为104～105/mL的实验条件下，液体培养基多在第24 h前后开始变为红色即提示Uu菌株生长，而在更换培养基之后，常未足48 h培养基即已变为深红色。此后若在第48 h再予以更换培养基，则会出现支原体无生长(培养基不再变为红色)或生长受抑制(培养基变红时间明显延迟)。可能是由于Uu的生长分为迟缓期、对数生长期、稳定器和迟缓期，在恢复生长之后首先是缓慢增殖，经历迟缓期后进入对数生长期而开始迅速增殖［4］。在环境稳定、营养充足的情况下，Uu后24 h的生长速度必然会快于前24 h，因而在48 h之前就会出现Uu过渡生长、大量分解尿素产氨碱化培养基，从而在过碱性的环境中迅速死亡或抑制生长。经重复实验发现，如果在第36 h时更换培养基，则不会出现明显的生长抑制的情况，同时可以维持Uu生长环境的稳定以及提供充足的营养，有利于Uu正常增殖。但是，更换培养基的次数增多无疑又增加了实验污染的风险。

2 Uu培养中的常见污染及分析

临床中判断Uu的生长状况主要根据肉眼观察培养基的颜色变化，其原理是根据Uu分解培养基中的尿素产碱使pH上升，而酚红指示剂在由酸变碱时颜色会由黄变红，如果培养基变为红色且液体澄清判读为Uu阳性，不变色且澄清则为阴性无污染。但是能分解尿素的微生物很多，已知脲酶阳性的有部分金黄色葡萄球菌及肠杆菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、新型隐球菌等等，这些杂菌的生长不仅会出现培养基浑浊，也会使培养基变红，从而影响对Uu生长的正确判断。

各种污染可能情况分析如下:①如果培养基不变红色而出现浑浊，常为不产脲酶的污染菌所污染且Uu为阴性，但是需注意由于有细菌生长竞争，会消耗培养液的营养成分，不排除不产脲酶细菌的浓度过高而抑制支原体生长出现假阴性;②理论上讲，只要待检标本中存在的脲酶阳性细菌，都有可能使培养基变红，但其结果还与细菌浓度有关。低浓度细菌(102～103/mL)的Uu培养管中液体仍清亮，呈黄色，无明显混浊，高浓度细菌(104～105/mL)的Uu培养管中液体呈红色，不同程度混浊［5］。同时出现红色与浑浊的培养基中，既可能为Uu阳性合并污染，也可能为产脲酶菌污染以及伴或不伴Uu生长，临床检验一般会判断阴性，但如果其中同时有Uu生长就会造成假阴性的判断［6］;③某些细菌在使Uu培养基变红的同时，培养基会出现异臭味，如变形杆菌、铜绿假单胞菌等则可直接排除［5］;④对于以上各种可疑的污染，实验中通常将污染结果剔除，也因此会由于重复操作而增加了实验成本。但有些污染的标本外观和Uu真阳性无法区别，这更值得注意，这种情况下需要增加质控项目，除应用孔径为0.45 μm的无菌滤膜过滤并进行Uu鉴别固体培养基培养鉴定外，还应在实验过程中对菌液与培养基随机取样，进行细菌分离及脲酶实验，出现分解尿素的细菌即判为污染。

总体而言，支原体培养基中污染菌的种类繁多、尚无简便易行的分离与鉴定方法，另外实验过程中各种污染途径尚具有偶然性与不可预测性，故多数不以污染菌为研究目的的支原体培养实验，例如支原体生物膜的培养与药敏试验，通常没有足够的条件、亦不可能对所有可疑的污染菌进行分离与鉴定。因此，监控实验污染最直接而有效的策略是规范无菌操作、严格控制高污染风险的操作环节、细致观察培养基、彻底剔除被污染的实验结果。

3 Uu生物膜培养与药敏试验中的污染途径及解决策略

由于支原体生长的生物学特性，使培养基pH发生改变，而偏碱性环境下Uu会迅速死亡的生物学特性，使实验中需要多次更换培养基并使菌液直接暴露，增加了污染的概率，培养过程中的杂菌污染由此成为决定Uu生物膜实验成功与否的一大关键问题。下文列举了实际操作过程中常见的污染途径与相应的质控策略，希望能对今后国内生物膜相关的实验研究起到借鉴作用。

3.1 Uu菌液的准备与保存

3.1.1 菌液准备实验所用的临床支原体菌株必须经过严格的培养、分离、鉴定过程:经微孔滤器过滤预处理杂菌，肉汤增菌观察颜色变化，将变红的增菌培养液转琼脂固体培养基，观察其典型菌落形成，依据菌落形态和有关生化、分子生物学技术进行鉴定，挑取单个的典型菌落转种至液体培养基，-72℃超低温冰箱冷冻保存［4］。

3.1.2 菌液存取即使拥有合格无污染的待测菌液，在菌液转移保存、菌液浓度测定、稀释菌液至实验浓度等环节中，也可能由于无菌操作的失误导致污染。例如，通常用1.5 mL EP管保存菌液，由于水凝固后体积增加，如保存菌液量过大(大于1.3 mL/管)则结冰后易膨胀甚至顶开EP管盖而导致污染，此时应将受污染的菌液弃去，再次取材重复操作。此外，实验早期就应做好纯化菌株的备份，并严格保证冻存菌液无污染，以及避免对备份菌液重复打开操作，以减少污染后的反复分离、鉴定。

3.2 Uu肉汤液体培养基及抗生素-培养基

3.2.1 培养基的配制各种原料应无菌处理后方可加入培养基，水质选择消毒无菌的双蒸水或超纯水，实验器材经泡酸及高温高压消毒，培养基配制完成后及使用过程中，应不定期取样置于温箱行无菌培养以排除污染。

3.2.2 培养基抑菌剂的选择目前Uu培养基一般添加的抗菌剂为青霉素类，青霉素类对大多数革兰阳性球菌的作用较强，但对阴性杆菌(常见变形杆菌)、真菌(常见白色念珠菌)无抑制作用，由此存在此类杂菌污染的风险。关于Uu培养基中抑阴性杆菌抗菌剂的选择，有研究［7］指出亚胺培南和哌拉西林/他唑巴坦对支原体无抑制作用，可用于抑制肉汤培养基中的阴性杆菌。氟康唑可以抑制常见的真菌污染如白色念珠菌，也不会抑制Uu生长，同时各种理化性质较稳定以及MIC较低，贾亚利等［8］研究认为31.25 μg/mL的氟康唑可以作为Uu培养基中真菌抑菌剂的首选。

3.2.3 更换培养基的操作①瓶装培养基:必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼，倾倒培养基时瓶口应凌空倒出，不宜直接接触吸槽或其他瓶口等，倒出后应再转动烧灼瓶口与瓶盖再盖上;②移液枪:使用多道移液枪添加或更换培养基时，培养基常置于吸槽，会直接暴露于空气中，易被空气悬浮颗粒污染，故吸槽应置于酒精灯旁的清洁区，同时操作动作要轻柔，尤其在打出移液枪中的弃液时，废液缸应远离吸槽，移液枪枪口不宜对着吸槽方向。另外，一般8孔移液枪相配套的200 μL枪头，在反复吸取培养基时，会在枪头内液体顶端出现气泡，并直接接触到移液枪受到污染，建议将每次的取液量减少1/2，即200 μL/孔的培养基量，改用100 μL/次的添加量操作2次，这样可以减少来自移液枪的污染。

3.2.4 设定阴性对照孔每次添加或更换培养基时，必须设立培养基的阴性对照孔，即只在孔中加入200 μL/孔的培养基及滴加石蜡油。同时需注意，由于可能在操作过程中造成污染，故每次添加培养基需设定2个空白孔，其一是操作前的培养基，其二是操作后的培养基，这样如果2孔均被污染提示吸槽或枪头消毒不彻底，或瓶装培养基污染，这时需再次检测培养基，以及消毒吸槽与枪头;如果仅第2孔出现污染，则提示培养基等无污染，污染来自操作过程，故应重复该次操作。

3.2.5 抗生素-培养基称取抗生素药粉，溶解稀释后应经微孔滤器预处理再用培养基稀释。稀释至目标浓度后，每个浓度的抗生素-培养基均需行无菌培养排除污染后方可使用，每一批操作向96孔板加入抗生素后，均应重复抗生素-培养基的无菌检测，如有污染则重新稀释配置。

3.3 操作环境与实验器材

3.3.1 生物安全柜的使用遵守生物安全柜操作说明，实验前清台面及内壁，紫外线照射30 min，将实验用器具外表面用75%乙醇喷淋或擦拭后放入生物安全柜，将循环过滤系统开启后方可开始实验操作。实验后应清洁台面及内壁，关闭循环过滤系统，紫外线照射30 min后方可关闭生物安全柜电源。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向，导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素，造成潜在污染的进一步传播［9］。

3.3.2 实验器材玻璃制品实验器材应洗刷干净，在浓酸溶液中浸泡过夜后反复清水冲洗，彻底去除酸液，合理包装并高温高压消毒30 min及烘干后方可使用。实验器材为一次性塑料制品如96孔细胞培养板，应购买合格、无菌、独立包装的产品，使用前检查产品包装密封性。EP管、枪头等一次性塑料用品，以及塑料吸槽等，应该用相应盒子包装、高温高压消毒30 min后方可使用，并且不宜多次实验反复使用，以更换培养基为例，每批更换后都应将此类器材重复清洁消毒。

3.4 石蜡油

3.4.1 石蜡油污染石蜡油会直接造成污染导致前功尽弃，应使用灭菌的石蜡油。

3.4.2 滴加石蜡油在往药敏板接种滴加石蜡油时，原先正放的石蜡油瓶会因倒置会混有空气，使下注后含有小气泡，当张力造成气泡破裂后，不能全部复盖住其下的接种液面，使培养基暴露而导致污染。同时，气泡破裂后，还会因为Uu生长产生的氨挥发而使pH值下降，药敏孔由红色再次变为黄色，出现假阴性结果或高-低药物浓度孔结果倒置。解决方法是在混有小气泡的孔中再补加1滴石蜡油，确保药敏孔被完全覆盖［10］。

4 展望

综上所述，生物膜体外药敏试验方法的建立和稳定性的探索，为Uu耐药机制的探讨提供了新的有力手段。随着生物膜培养和药敏方法的推广，样本量和实验规模不断扩大，实验室培养的污染概率也会随之增高。生物膜体外培养过程中存在多种潜在的污染途径，因而对杂菌污染的有效预防和监控，是Uu生物膜实验中必须要解决的一个重要问题。提高对Uu生物膜培养和药敏检测各环节中污染途径的重视，进行细节上的严格控制和改进，降低杂菌污染对生物膜实验的干扰和危害，对生物膜的研究具有重要的意义。

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