分子标记在松科植物种质资源研究中的应用

李红艳 罗 旭 张海峰

(黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081)

分子标记技术也称DNA分子诊断技术，是基于研究DNA分子由于缺失、插入、易位、倒立、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性。它反映生物个体或群体间在基因组上某种差异特征的DNA片段，与表型标记相比，分子标记具有以下优越性：(1)直接以DNA的形式表现，在动植物体的各个组织，各发育时期均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍及整个基因组；(3)多态性高，自然存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必须连锁；(5)许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息[1]。分子标记技术发展迅速，种类包括：限制性片断长度多态(Restriction Fragment Length Polymorphism,简称RFLP)、随机引物扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,简称RAPD)、扩增片段长度多态(Amplified Fragment Length Polymorphism，简称AFLP)、SSR/VNTR(简单序列重复或微卫星/数量可变串联重复或小卫星)、微卫星引动的PCR(MP-PCR)、锚定的SSR-PCR、PCR扩增微卫星位点等。

林木种质资源是国家重要的基础战略资源，是林木良种选育的基础。长期以来，林木种质资源的评价、保存与利用工作十分薄弱，种质资源的流失非常严重。我国虽然树种资源丰富，但森林资源贫乏，大量具有特殊价值和利用潜力的树种的遗传资源及其有效群体逐渐减少，种质资源的流失，不仅对林木良种选育工作造成很大损害，而且对整个森林生态安全已经构成威胁。利用分子标记技术对种质资源进行研究是一个新的学科方向，近年来分子标记技术越来越多地应用于松科植物种质资源研究工作中。

1 物种鉴定及种间亲缘关系分析

林木种子的真实性鉴定，一直是种苗生产、贸易中的突出问题。一些亲缘关系较近的种，特别是松科中松属及落叶松属的某些种，其种子甚至幼苗的形态都非常相似，往往难以根据形态对其进行区分。另外，落叶松的一些杂交种往往集合了双亲的优点，在种子园中这些杂交种和它们的亲本种子很难鉴别，甚至生长几年后也难以区分[2]。对于不同的物种，其基因组DNA所携带的遗传信息必然有所不同，只不过亲缘关系近的物种差异程度小，亲缘关系远的差异程度大。因此，DNA分子标记被越来越多地用于物种鉴定和种间亲缘关系分析。早在1992年，Bobola等[3～5]利用RFLP标记技术对红云杉和黑云杉进行了鉴别，虽然获得的标记不具有100%种的特异性，但通过细胞器和核基因组RFLP标记的组合，可以对红云杉和黑云杉进行可靠的区分。1995年，Perron等[6]对红云杉和黑云杉进行研究，获得了所有检测样本4个种一级水平上100%保守的RAPD标记。1996年，Khasa[7]等用RAPD片段作为标记区别云杉属不同种白云杉、恩氏云杉以及它们的杂交种。1997年，Furman等[8]获得了中美洲和墨西哥几个松属树种一级水平上的特异的RAPD谱带。1999年，Germano等[9]用SNPs做分类群鉴定，区别红云杉、黑云杉、白云杉。2000年Scheepers等[10]用RAPD的方法鉴定落叶松和其杂种，得到了特异的RAPD条带。2003年，Nkongolo等[11]从多脂松(Pinusresinosa)中分离了少量的微卫星DNA引物，其中的一对引物产生了丰富的信息，可以用来鉴别松树树种。2004年，Achere等[12]根据叶绿体基因组父系遗传，而线粒体基因组母本遗传的特性，用PCR-RFLP的方法扩增了叶绿体基因组基因，通过酶切片断的差异区分了日本落叶松和欧洲落叶松，结合线粒体基因特异片断，区分落叶松的父本和母本；同年，我国国家质量监督检验检疫总局也出版了用RAPD进行落叶松种子鉴定的实验方法[13]。2005年，赵阿风[14]用8对SSR引物的指纹组合建立了福建省五一林场马尾松无性系测定林的DNA指纹图谱，可以简便有效地区分开全部供试的120个不同无性系。2006年，曲丽娜等[15]采用RAPD和ISSR分子标记对兴安落叶松、华北落叶松和长白落叶松进行不同物种的种间鉴别，得到鉴别三种落叶松苗木的3个RAPD引物，鉴别三种落叶松种子的3个RAPD引物和2个ISSR引物。2008年，张磊等[16]采用ISSR分子标记技术对兴安、长白和日本落叶松种间以及不同无性系进行了鉴别，从49条引物中筛选出13条ISSR引物可以对落叶松种间和无性系间进行鉴别，特异条带个体的百分率为100%。2009年，郭树杰[17]利用RAPD技术对陕西陇县八渡林场油松种子园14个无性系进行鉴别，其中6个RAPD引物可有效对14个无性系进行分子鉴别。

2 群体遗传结构及遗传多样性分析

遗传多样性泛指地球上所有生物的遗传信息的总和，包括不同物种间以及物种内的遗传变异。狭义上遗传多样性通常指物种内的不同种群内不同个体间的遗传变异[18]。它反映着一个物种适应环境的能力及其被改造和利用的潜力。遗传结构就是遗传变异或者基因和基因型在时间和空间上的分布式样，它受突变、基因流、自然选择和遗传漂变的共同作用，同时还和物种的进化历史和生物学特性有关[19]。遗传多样性是生物界几十亿年进化所产生的宝贵资源，是人类生存和社会生产发展的基础。遗传多样性的研究为揭示生物分子进化、地理变异和物种形成提供了强有力的证据和方法，是保护人类赖以生存的种质资源的基础，是推动生命科学进步的重要工具。

在松科植物的遗传多样性研究中，以张恒庆等对凉水国家自然保护区天然红松的研究报道较多。对天然红松遗传多样性在时间尺度上变化的RAPD分析结果表明：红松在时间尺度上的遗传分化比空间尺度的低，凉水保护区内的红松遗传多样性在1581—1900年的时间段内没有太大的波动，龄级间遗传多样性分化不明显，红松遗传多样性主要存在于龄级内[20，21]。对凉水、丰林国家自然保护区红松居群遗传多样性的研究，无论采用RAPD标记，还是ISSR标记，结果均表明：红松的遗传多样性凉水居群大于丰林居群。对比分析了这两个天然红松居群的遗传多样性变化，红松种内的遗传变异主要存在于居群内，居群内存在一定的遗传分化[22～25]。冯富娟等[26]利用ISSR技术分析了长白山不同海拔高度红松的遗传分化，发现该地区的遗传多样性水平呈现随海拔升高而降低的趋势。长白山不同海拔高度红松的变异主要来自群体内，红松之间的遗传距离和垂直地理距离之间有明显的正相关性。推测：红松的垂直分布由低海拔向高海拔处扩散而形成的。杨传平等[27]应用ISSR技术，以俄罗斯的西伯利亚红松不同地理分布区的19个种源为材料进行遗传多样性研究，结果表明：种源的平均多态位点比率为26.48%，具有高的遗传多样性，种源间存在一定程度的基因流动和遗传分化。此外，张冬东[28]利用SRAP技术分析露水河林业局红松种子园种源试验林中24个种源的遗传结构，王洪梅[29]利用ISSR分子标记技术分析了露水河种子园和天然红松的遗传多样性和遗传结构，结果均表明：群体的遗传变异主要存在于种源(群体)内。

马尾松遗传结构和遗传多样性研究方面，艾畅等[30]对福建五一，朱必凤等[31]对广东韶关，张薇等[32]对福建白砂，万爱华等[33]对湖北京山，杨玉洁等[34]对湖南桂阳马尾松种子园的遗传结构和遗传多样性进行了分析，结果表明马尾松种子园均具有较高的遗传多样性。李丹等[35]采用RAPD技术分析测定了3个马尾松海拔梯度种群的分子遗传特征，发现马尾松种群中遗传多样性较高，种群间的分化程度较低，大部分变异存在于种群内。刘爱萍[36]用RAPD和ISSR标记对我国12个省(区)马尾松优良种质资源代表品种进行了亲缘关系和遗传多样性分析，多态性百分率分别为89.5%和88.9%。李志辉[37]等用ISSR标记对广西古蓬和浪水两个种源区的马尾松天然林5个群体共85份样品进行遗传多样性分析，古蓬种源多态位点百分率为94.35%，浪水多态位点百分率为94.38%，表明马尾松天然林群体内遗传多样性水平高，个体间基因多样性变异大。

油松是我国的特有树种，从目前研究的有关资料来看，国外的研究报道甚少，国内最近几年对油松的遗传多样性和遗传结构研究的较多。2008年，李毳[38]利用RAPD和ISSR两种分子标记方法对山西5个天然油松群体进行了遗传多样性分析；周飞梅[39]等，利用RAPD分析了陕西地区油松天然群体的遗传结构；2009年，王磊[40]利用随机微卫星扩增多态性DNA(RMAPD)分子标记技术，分析了油松12个天然居群245个个体的遗传多样性和遗传结构；郝真真[41]采用ISSR分子标记方法，研究了油松整个分布区的13个代表种种群遗传多样性和空间遗传结构特征。结果均表明：种群间有一定程度的变异，但大部分变异存在于种群内。

对于松科其他植物，1993年，Strauss等[42]利用RAPD技术分析了日本落叶松的遗传多样性，Hong等[43]分析了辐射松、刺果松和瘤果松线粒体DNA的RFLP遗传多样性。1995年，Hamelin等[44]应用RAPD标记研究了美国白松22个群体的核DNA的遗传变异, Vicario等[45]采用12个随机引物对7个冷杉群体进行RAPD标记的遗传多样性研究。1996年，Szmidt等[46]对欧洲赤松的两个群体进行了RAPD分析，Bobola等[47]分析了红云杉和黑云杉基因组rDNA的 RFLP遗传多样性。1998年，Echt等[48]利用SSR技术分析了脂松的遗传多样性。1999年，Lerceteau和Szmodt[49]利用AFLP技术研究了樟子松的遗传多样性；Rajora[50]基于RAPD标记分析了来自天然林、天然次生林、人工林和树木改良选择林共420株白云杉的遗传结构。2000年，Collignon and Favre[51]分析了挪威云杉的RAPD遗传多样性；Karhu等[52]分析了黑松的RAPD及STR遗传多样性；易能君等[53]分析了湿地松抗病种子园的遗传多样性。2001年，Mariette等[54]利用AFLP和SSR技术对23个种群的海岸松进行遗传多样性研究；Vikram等[55]用AFLP标记研究严酷的气候条件和微生态环境对挪威云杉群体遗传结构的影响。2002年，Kraj[56]基于RAPD多态性分析原产于波兰的挪威云杉群体的遗传变异。唐娟娟等[57]利用RAPD分析了黄山松10个家系的遗传多样性。2003年，Diaz and Ferrer[58]用RGAP标记分析了卵果松群体遗传变异，张志勇和李德铢[59]分析了五针白皮松的RAPD遗传多样性。2004年，王秋玉等[60]对红皮云杉地理种源遗传多样性进行了RAPD分析，张新叶等[61]利用cpSSR分子标记对日本国内的7个日本落叶松群体遗传结构进行了研究。2005年，税珺等[62]对火炬松19个原生种源和国内早期引进的5个群体进行RAPD遗传多样性研究。2006年，周志强等[63]研究了大兴安岭北段天然樟子松林遗传多样性，那冬晨等[64]利用ISSR标记对17个兴安落叶松种源170个个体遗传多样性进行了分析。2007年，刘占林和杨雪[65]研究了巴山松(P.henryiMast.)、黄山松、油松、马尾松以及云南松(P.yunnanensisFranch.)5种松树的遗传多样性。

3 分子遗传图谱构建

遗传图谱(genetic map)又称连锁图(linkage map)，是以具有多态性的遗传标记为路标，以两个位点的交换率为图距的图谱，它包括将基因定位于某一特定染色体上，以及测定基因在染色体上线性排列的顺序和距离。遗传图谱既是遗传研究的重要内容，又是种质资源、育种及分子克隆等许多应用研究的理论依据和基础。

分子标记从一产生就在松科植物遗传连锁图谱构建中得到了广泛的应用和认可。据统计显示，迄今国内外利用RAPD、RFLP、AFLP和微卫星标记对松科植物已经构建了20多张遗传连锁图谱。Tulsieram等[66]最早利用RAPD标记构建了白云杉的遗传图谱，用相同的技术，又相继建成了多种松科植物的遗传图谱，如湿地松、长叶松、糖松、海岸松、欧洲赤松、土耳其松、南欧海松、北美乔松、马尾松、挪威云杉等[67～77]。

随着RFLP和AFLP标记技术的开发，RFLP和AFLP标记技术也被用于松科植物遗传连锁图谱构建中。1994年，Devey等[69]首先构建了火炬松的RFLP遗传图谱；之后，Remington等[78]利用AFLP标记技术又构建了一张较为完整的火炬松的遗传连锁图谱，建立起来的完全连锁图谱可将现存的火炬松图谱合并成高密度图谱；1998年Travis等[79]构建了赤松的AFLP遗传图谱；2003年Yin等[80]构建了樟子松的AFLP遗传图谱。此外，Devey等[81]用RAPD、RFLP和SSR标记构建辐射松的遗传连锁图谱，Costa等人[82]利用AFLP、RAPD和蛋白质标记构建了含有239个AFLP标记、127个RAPD标记和31个分离蛋白的一张长叶松遗传连锁图谱。

比较基因组研究就是利用共同的分子标记在相关物种中进行物理或遗传作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布情况，揭示染色体片段上同线性或共线性的存在，从而对不同物种的基因组结构及基因组进化历程进行精细分析。比较基因组作图需要用相同的标记构建不同种的遗传连锁图，在松科植物中比较基因组作图也取得了一定的进展，Devey等[83]用RFLP和SSR标记构建了火炬松和辐射松的比较遗传图谱；Brown等[84]构建了火炬松与湿地松的RFLP及EST的比较遗传图谱；Komulainen等[85]用EST、AFLP及SSR标记构建了欧洲赤松与火炬松的比较遗传图谱。Mitchell等[86]将两张不相关的三代群体火炬松连锁图整合成一张较完整的连锁图，整合后的火炬松遗传连锁图含有357个标记，分属于12个连锁群，覆盖火炬松基因组约1 300cm，整合后的这张连锁图可作为火炬松的一张参考遗传连锁图，为研究松科植物结构和进化关系奠定了基础。

4 问题与展望

综上所述，分子标记在松科植物种质资源中已有较多的应用，取得了相应的研究成果。但从报道的情况看还存在以下问题：(1)目前应用于松科植物的分子标记中，RAPD技术用得较多，其他分子标记技术没有被广泛地应用，尤其是一些较新的分子标记技术在松科植物中没有应用；(2)已构建的松科植物遗传图谱的标记大部分小于300个，密度较低，不能对简单及复杂的经济性状进行精确定位；(3)我国在松科植物上这方面的研究还做得很少，研究的广泛与系统性以及研究的层次与深入的程度上，与国际水平差距较大。因此，在今后的研究中，应该加强国际国内交流合作，积极主动地开展这方面的基础性研究，针对松科植物本身的生物学特性和生产中的突出问题，发展适合松科植物自身特点的理论和分析方法，开展多种分子标记的研究，提高标记的多态性和稳定性，构建高密度的遗传连锁图谱、定位重要生长性状和经济性状，通过有效的选择手段，从古老品种或野生种中鉴定出一些优良性状基因，并将这些优良遗传物质引入栽培品种中，拓宽松科植物主要栽培树种的遗传基础，加速松科植物遗传改良的进程，为种质资源的保护及开发利用提供极为重要的科学理论依据和良好的技术条件。

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