硫酸锌对镉染毒至脐静脉内皮细胞损伤的影响

詹杰 柳承希 李延龙 魏树和 张静生

镉(Cd)是常见的环境和工业毒物，可通过食物、饮水、吸烟等途径进入人体。一般认为其生物半衰期长达10～35年，很少量的镉进入体内就可因为生物蓄积和生物放大作用对机体产生一系列的损伤作用，因而镉被美国毒物管理委员会(ATSDR)列为第六位危机人体健康的有毒物质。近年研究表明，镉的毒害作用也是引起动脉硬化、高血压等心脑血管的原因之一，因此研究镉中毒性动脉硬化致病机制及防治方法有重要的实际意义。锌是人体必需元素，参与酶分子结构、基因表达、信号传导、细胞黏附、mRNA更新、抗氧化等多种生理功能，缺锌与血管硬化和心脏病发生有关［1］。本文利用人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECS)体外培养实验，观察锌对镉染毒血管内皮细胞的防护作用与可能机制。

1 资料与方法

1.1 材料

1.1.1 人脐带静脉内皮细胞(HUVECS)，辽宁中医药大学附属医院科研实验中心提供。健康Wister大鼠36只(动物合格证号:SCXK(辽)2003-0016)，雄性，体质量300 ～350 g。

1.1.2 试剂 DMEM(GIBCO公司);无菌灭活小牛血清(GIBCO公司);NO试剂盒(南京建成生物公司);人sICAM-1ELISA试剂盒、人细胞色素C ELISA试剂盒(上海瑞齐生物公司);Annexin V/PI凋亡试剂盒(北京宝赛生物公司)。氯化镉、硫酸锌等试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器 酶标仪(BID RAD);724型可见光分光光度计(上海分析仪器);CO2培养箱(THERMO);IX-70荧光倒置显微镜(Olympus日本);高速冷冻离心机(SIGMA);双人净化台(苏州净化);流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 共分3组。空白组(normal group，NG):空白血清处理的 HUVECSS细胞;模型组(Cd):1、5、10、30和60 μm不同浓度镉(Cdcl2)血清处理的HUVECSS细胞;补锌组(Cd+Zn):不同浓度镉及硫酸锌血清处理的HUVECS细胞。

1.2.2 药物血清制备 按药物血清制备通法，补锌组按人的每天等效剂量的10倍硫酸锌浓度1 mg/ml，2 ml/(次·只)灌胃，正常对照组和模型组以0.9%氯化钠注射液等量灌胃，1次/d，连续3 d，末次灌胃给药1 h后腹主动脉采血，分离血清，-85℃超低温冰箱保存备用。

1.2.3 细胞培养及细胞损伤模型的建立 HUVECS细胞株，采用2.5 g/L胰酶消化，加入含20%胎牛血清DMEM培养液，置于37℃CO2培养箱中进行传代培养，至细胞呈单层铺路石样融合状态后，再用2.5 g/L胰蛋白酶消化，得到细胞悬液。将细胞悬液调整为5×105/ml，接种于24及96孔板，加入各组药物血清，培养48 h后进行指标测试。

1.3 指标检测

1.3.1 硝酸还原酶法 测定NO:取细胞培养液100 μl，于波长550 nm测定吸光度，计算细胞培养液中NO含量。

1.3.2 ELISA法 采用酶联免疫双抗体夹心法测定细胞培养上清液中可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)和细胞色素C(Cyt C)的含量。每组设3复孔，分别用酶标仪450 nm波长下测定吸光度，按标准曲线计算出待测样品中sICAM-1和Cyt C的含量。

1.3.3 流式细胞仪 Annexin V/PI-FITC染色法分析细胞凋亡率:取上述分组1 ml细胞，1000 rpm，4℃离心10 min，弃上清;加入1 ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮;1000 r/min 4℃离心10 min，弃上清，重复两次。将细胞悬浮于200 μl的binding buffer;加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI，轻轻混匀，避光室温反应15 min;加入300 μl的binding buffer后用流式细胞仪检测(Ex=488 nm;Em=530 nm)细胞凋亡的情况，判定早期及晚期凋亡率。将细胞混合液离心，取细胞沉淀涂片，荧光显微镜下观察。

1.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件包进行多因素方差分析及LSD两两比较。实验数据以均值±标准差()表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对镉染毒血管内皮细胞损伤后的NO、sICAM-1和Cyt C的影响(表1) 镉染毒的血管内皮细胞NO值明显低于正常对照组(P＜0.01)，sICAM-1浓度和Cyt C值明显升高(P＜0.01);而镉染毒同时补充硫酸锌组血管内皮细胞的损伤明显减轻，NO值明显高于Cd组(P＜0.01)，sICAM-1浓度和Cyt C值明显降低(P＜0.01);其中，Cd+Zn组NO和Cyt C浓度(60 μm除外)与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 流式细胞术Annexin V/PI染色法分析细胞凋亡率(表2，图3) 按照Annexin V/PI-FITC荧光染色结果的判定标准，对实验散点图相应数据进行统计学分析，结果显示，正常对照组的早期与晚期凋亡率即LR与UR之和为(5.28±2.44)%，与正常对照组相比，镉染毒组 5、10、30、60 μm 的早期与晚期凋亡率之和均显著增加(P＜0.01)，其中镉染毒60 μm组高达(39.49±39.03)%，而Cd+Zn组处理后，此数值显著下降(P＜0.01)，与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 锌对镉染毒血管内皮细胞损伤后NO、sICAM-1和Cyt C的影响()

表1 锌对镉染毒血管内皮细胞损伤后NO、sICAM-1和Cyt C的影响()

注:与空白对照组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01

镉(μm)NO(μmol/L)sICAM-1(ng/L)Cyt C(nmol/L)Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn Cd Cd+Zn NG 84.53±2.14 38.55±2.12 15.91±0.781 36.67±3.52* 90.43±4.21△ 50.25±3.71* 48.02±4.29* 31.13±1.44* 19.97±2.02△5 35.05±3.07* 89.06±3.27△ 65.17±6.01* 50.34±3.71＊△ 35.69±5.42* 19.47±4.01△10 34.19±4.43* 90.51±3.11△ 69.18±4.89* 50.61±4.11＊△ 38.87±3.71* 20.53±5.66△30 33.25±3.89* 81.19±2.56△ 71.32±5.46* 52.57±4.02＊△ 38.92±3.90* 20.78±7.10△60 29.91±5.18* 69.23±4.37△ 82.86±6.37* 55.88±6.13＊△ 45.53±7.74* 23.35±4.16＊△

表2 锌对镉染毒血管内皮细胞凋亡率的影响()

表2 锌对镉染毒血管内皮细胞凋亡率的影响()

注:与空白组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01

LR+UR(%Gated)0 μm 1 μm 5 μm 10 μm 30 μm 60 μm 5.28±2.44 - - - - -Cd组 - 5.57±4.08 12.44±4.44* 13.97±5.81* 16.09±6.22* 39.49±39.03*Cd+Zn组 - 2.80±4.02 2.51±4.58△ 3.06±2.23△ 4.30±3.82△ 4.36±2.25空白组△

图1 Annexin V/PI染色法细胞凋亡率比较

3 讨论

锌是一种人体必需的微量元素，已知六大类、300多种酶的活性中心都有锌的存在。锌可调节基因表达，一些蛋白质的特定序列可与锌结合产生锌指结构序列(Zinc finger motif)，后者可与DNA特异序列结合，在基因转录调控中起重要作用。此外，锌还参与信号传导、细胞黏附、mRNA更新、稳定膜结构、增强膜结构的抗自由基能力等重要生理功能［1］。

研究证实，镉对人体具有多器官、多系统毒性，其毒性机制与诱发过氧化物生成、引起DNA损伤、线粒体受损、干扰细胞信号传导系统等多途径有关，机制十分复杂［1］。舒张和收缩因子、促凝和抗凝因子及生长抑制和生长促进因子的平衡失调导致血管内皮功能障碍、单核细胞与血管内皮细胞黏附，以及血管内皮细胞与平滑肌的凋亡均可能是各器官镉染毒损伤的重要机制之一。内皮源性NO是天然血管保护剂和抗动脉硬化分子，病变血管内皮NO合成下降和破坏增多是内皮依赖性血管舒缩异常的主要原因［2，3］。黏附分子sICAM-1在血管内皮损伤过程中，通过信号分子传递，激活转录因子NFKB，与靶基因细胞黏附分子基因位点结合，上调内皮细胞的黏附分子基因及黏附分子的表达，并介导单核细胞黏附、迁移穿过内膜，始动AS早期的细胞行为［4］。而Cyt C的释放被认为是细胞凋亡程序中的关键一步，在凋亡初期，Cyt C从线粒体内膜释放，从而启动了线粒体的凋亡机制［5］。

本实验观察到内皮细胞镉染毒损伤24 h后，sICAM-1含量明显增加，NO水平下降，Cyt C浓度上升，且有与镉水平呈正相关趋势，5 μm水平以上镉可引起内皮细胞的凋亡率明显增加。Zn可升高NO水平，sICAM-1、Cyt C含量均明显下降，内皮细胞凋亡率明显降低，提示镉染毒同时补锌可抑制由镉染毒造成的内皮功能障碍和内皮细胞凋亡，抑制了单核-内皮细胞黏附，保护内皮细胞，进而减少AS的发生。其作用机制、量效关系和安全性值得进一步研究。

［1］余元勋，胡玲玲，余国斌主编，中国医学分子微量元素学，安徽科学技术出版社，2009.

［2］Moncada S，Nitric oxide.Journal of Hypertension，1994，12(810):S35-39.

［3］Meredith IA，Yeung AC，Weidinger EF，et al.Role of impaired endothelium dependent vasodilation in ischemic manifestation of coronary artery disease.Circulation，1993，87(Suppl):56-66.

［4］Rahman A，AnwarKN，Minhajuddin M，et al.cAMP targeting of p38 MAP kinase inhibits thrombininduced NF-κB activation and ICAM-1 expression in endothelial cells.American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology，2004，287(5):1017-1024.

［5］Morita-Fujimura Y，Fujimura M，Kawase M，et al.Release of mitochondrial cytochrome C and DNA fragmentation after cold injuryinduced brain trauma in mice:possible role in neuronal apoptosis.Neuroscitt，1999，267(3):201-205.